쥐 척추에서 DRG 수확: 쥐 모델의 척추에서 등뿌리 신경절을 추출하는 절차

초록

출처: Schmidt, L. B. et al. 두경부암에서 신경주위 침습을 평가하기 위한 병아리 융모막 박막 생체 내 모델. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 다운스트림 적용을 위해 채취된 쥐 척추에서 등뿌리 신경절 또는 DRG를 추출하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. DRG의 수확 및 준비(예상 시간: 2시간, 8일차)

참고: 생쥐와 쥐를 사용한 실험은 IACUC의 승인이 필요합니다. 일부 국가에서는 닭고기 달걀을 사용하려면 승인이 필요합니다.

1. 6-7주 된 Sprague Dawley 쥐(체중 ~200g)를 가져와 DRG를 추출합니다.
   메모: 한 마리의 쥐는 ~40개의 경추 및 흉부 DRG를 산출해야 합니다. 마우스 DRG는 또한 CAM에 통합됩니다. 그러나 이 종의 조건은 독립적으로 최적화되어야 합니다.
2. 층류 캐비닛에서 다른 곳에 발표된 마우스 DRG 추출 프로토콜에 따라 경추 및 흉부 영역에서 DRG를 수확합니다. DRG를 수집하는 방법에 대한 방향은 그림 1을 참조하십시오.
   1. 복강내 주사된 케타민/자일라진을 투여한 후 심장 천자로 쥐를 안락사시킵니다. 70% 에탄올로 쥐 피부를 청소하고 가위를 사용하여 쥐 척추를 제거합니다. 경추 탈구는 경추 DRG를 손상시킬 수 있으므로 시술하지 마십시오.
   2. 경추, 흉부 및 요추 부위를 그림 1A-D에 제공된 개략적인 해부학적 표현과 전체 이미지에 따라 동일한 가위로 분리합니다. 조직이 젖지 않도록 10X PBS가 있는 1cm 배양 접시에 척추 부분을 놓습니다.
   3. 섬세한 뼈 가위로 등쪽과 복부 측면의 척추 뼈를 열고 척추를 두 개의 측면 반쪽으로 분리합니다(그림 1E-F).새로운 10X PBS가 있는 깨끗한 1cm 접시에 조직 섹션을 놓습니다.
   4. 겸자를 사용하여 척추뼈에서 척수를 부드럽게 분리하여 DRG를 시각화합니다(그림 1G).
   5. 각 DRG 아래에 가는 집게를 잡고 DRG가 박혀 있는 골강에서 꺼냅니다. DRG는 조직 손상을 유발할 수 있으므로 DRG를 직접 잡지 마십시오. DRG에서 축삭돌기를 자르지 마십시오(그림 1H).
      메모: 요추 DRG는 CAM에서의 통합을 감소시키므로 사용하지 마십시오. DRG 영역 위치의 경우 그림 1A-D의 개략도와 총 해부학적 이미지를 따릅니다.
3. 수확 직후, 각 DRG를 2% 페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strepin) 및 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM 배양 배지에 넣어 DRG의 박테리아 오염을 방지합니다.모든 DRG를 4mL의 배양 배지와 동일한 6cm 배양 접시에 그룹화합니다.
4. 모든 DRG를 수확한 후 2% Pen/Strep과 10% FBS가 보충되고 1.25μg/mL의 적색 형광 염료가 함유된 DMEM 배양 배지가 있는 새로운 배양 접시로 옮깁니다. 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.

결과

그림 1 : 8일차에 DRG 추출. A. 척추의 해부학적 위치를 보여주는 쥐 회로도. B. 다른 신체 부위를 보여주는 쥐의 척추 구조 다이어그램; 경추는 녹색, 흉추는 진한 파란색, 요추는 주황색, 천추는 하늘색입니다. C-D. 외과적 절제 후 쥐 척추의 복부 측면; B에 표시된 것과 같은 영역의 분리. E. 척추 뼈를 절개하여 척수관을 열고 척추체를 DRG를 포함하는 두 개의 측면 섹션으로 분리합니다. 절편은 정중선에서 각 척추 뼈의 등쪽과 복부 측면을 절단해야 합니다. F. 열린 흉추의 전체적인 측면.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS(1x) pH 7.4	지브코	# 10010-023	인산염 완충 식염수
Sprague Dawley 쥐 (암컷)	찰스 리버 연구소	스트레인 코드: 001	생후 6-7주(체중 190-210g)
Dumont # 5 파인 집게	정밀 과학 도구(FST)	# 11254-20	DRG를 수확하는 데 사용됩니다
매우 가는 Graefe 집게, 곡선형	정밀 과학 도구(FST)	# 11151-10	8일째에 DRG를 CAM에 이식하고 17일째에 CAM 조직을 수확하는 데 사용됩니다
매우 세밀한 Graefe 집게, 스트레이트	정밀 과학 도구(FST)	# 11150-10	8일째에 DRG를 CAM에 이식하고 17일째에 CAM 조직을 수확하는 데 사용됩니다
DMEM(1개)	지브코	# 11965-092	Dulbeecco's Modified Eagle 미디엄
CellTracker Red CMTPX 형광 염료	생명 기술	# C34552	DMSO의 40μL에서 50μg을 재구성하고 -20oC에서 재고를 구성합니다. 1μL의 원액/배양 배지 mL 사용
펜/연쇄상구균	지브코	# 15140-122	10,000 units/mL 페니실린, 10,000 μg/mL 스트렙토마이신
안녕 FBS	지브코	#의 10082-147	열 비활성화 소 태아 세럼
디엠소	Fisher 생물 시약	# BP231-100	디메틸 설폭 사이드

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