Chick Chorioallantoic Membrane 또는 CAM Tumor Model: An An An In Ovo Method to simulate Perineural Peripheral Imaging of Tumor Cells (병아리 융모대박막 또는 CAM 종양 모델: 종양 세포의 신경주위 침입을 시뮬레이션하기 위한 In Ovo 방법)

초록

출처: Schmidt, L. B. et al. 두경부암에서 신경주위 침습을 평가하기 위한 병아리 융모막 박막 생체 내 모델. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 신경 주위 침습을 연구하기 위해 병아리 융모축막(CAM)에서 등뿌리 신경절과 암세포를 공동 배양하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. CAM에 DRG 접목(예상 시간: 40분, 8일차)

1. 이식 전에 DRG를 세척하기 위해 HBSS 배지가 있는 6cm 배양 접시를 준비합니다. 준비된 난자를 세포 배양 층류 캐비닛으로 가져옵니다. 계란에서 파라핀 멤브레인을 제거합니다(그림 1A).
2. 미세한 멸균 집게로 배양 배지 내부에서 하나의 DRG를 부드럽게 잡습니다. HBSS 배지에 담그어 형광 염료가 포함된 여분의 배지를 제거합니다. DRG를 매우 부드럽게 잡으십시오. 그렇지 않으면 집게에 달라붙습니다.
3. 멤브레인에 구멍이 나지 않도록 주의하면서 DRG를 CAM에 놓습니다(그림 1B-C). 필요한 경우 다른 집게를 사용하여 CAM에 놓을 때 집게 끝에서 DRG를 분리하는 데 도움이 됩니다.
   메모: DRG를 HBSS 매체로 젖은 상태로 유지하면 겸자에서 쉽게 분리할 수 있습니다.
4. 멸균 투명 필름 드레싱으로 계란을 덮습니다. 박테리아 오염을 방지하기 위해 달걀 껍질에 만들어진 모든 창문과 구멍을 덮으십시오(그림 1D).
5. 모든 난자에 DRG를 접목한 후 38°C, 습도 54%의 가습 인큐베이터에서 회전하지 않고 2일 동안 알을 부화합니다.

2. CAM에 종양 세포 이식 (예상 시간 : 1 시간 30 분, 10 일째)

1. 세포를 이식하기 48시간 전에 배양 플레이트에 필요한 세포를 플레이트에 플레이트화합니다. CAM에서 3차원 종양을 생성하기 위해 UM-SCC-1 세포에 대해 난자당 0.5-1 x 10⁶개의 세포를 계산합니다. 세포 수는 세포주에 따라 다를 수 있습니다.
2. 배지를 흡입하고 1% Pen/Strep과 10% FBS 및 2.5μg/mL의 녹색 형광 염료가 보충된 DMEM 배양 배지를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 현미경에서 형광 강도를 확인하고 배지를 흡인하고 1X PBS로 한 번 세척하고 최대 10분 동안 0.25% 트립신을 추가합니다. DMEM에 의하여 보충된 매체를 가진 trypsin를 중화하십시오.
3. 250 x g에서 4분 동안 원심분리기를 하여 세포 펠릿을 형성합니다. DMEM 배지를 흡입하고 HBSS에 재현탁하여 과도한 형광 염료를 세척합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다.
4. 난자를 세포 배양 층류 캐비닛으로 가져옵니다. 가위와 집게로 계란을 덮고 있는 투명 필름 드레싱을 엽니다(그림 1E-F).
5. 계산된 세포 수를 다시 원심분리하고, HBSS 배지를 흡인하고, 동일한 배지의 5μL당 0.5 - 1 x 10⁶ 세포의 최종 농도로 재현탁합니다(그림 1G). 총 난자 수에 필요한 양을 준비합니다(난자당 5μL의 세포 현탁액).
6. DRG에서 약 2mm 떨어진 CAM에 5μL의 셀 용액을 놓습니다(그림 1H). DRG와 셀 사이의 거리를 균일하게 유지합니다. 세포의 확산을 최소화하기 위해 난자를 방해하지 않도록 각별히 주의하십시오.
   메모: 세포 이식을 시작하려면 CAM 표면이 시각적으로 건조한 난자를 선택하십시오. 표면이 너무 젖으면 세포가 퍼져 일반 종양을 형성하지 못할 수 있습니다.
7. 1.4단계와 같이 새 필름 드레싱으로 계란을 덮습니다. 모든 난자의 세포를 접목합니다. 38°C, 54% 습도의 가습 인큐베이터에서 회전하지 않고 7일 동안 알을 부화시킵니다.

결과

그림 1: DRG, 세포 이식 및 CAM 수확: 8일차: A. CAM은 파라핀 왁스 멤브레인 제거 후 쉽게 관찰됩니다. BC 미세한 겸자로 DRG를 CAM에 놓습니다. 계란은 필름 드레싱으로 덮여 인큐베이터에 넣습니다. 화살표는 덮인 개구부를 가리킵니다.10일차: E-F. 필름 드레싱이 제거되고 DRG가 배치됩니다(F의 화살표). 지-H. 5μL의 셀 용액을 DRG에서 ~2mm 거리의 CAM에 떨어뜨립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
계란 부화기	GQF 디지털 스포츠맨	#의 1502	계란 인큐베이터, 자동 회전기, 디지털 온도 조절기, 온도 및 습도 조절 장치가 장착되어
조각 커터	드렘	#108	달걀 껍질을 뚫는 데 사용됩니다.
매우 가는 Graefe 집게, 곡선형	정밀 과학 도구(FST)	#의 11151-10	8일째에 CAM에 DRG를 이식하고 17일째에 CAMtissue를 수확하는 데 사용됩니다
매우 세밀한 Graefe 집게, 스트레이트	정밀 과학 도구(FST)	#의 11150-10	8일째에 DRG를 CAM에 이식하고 17일째에 CAM 조직을 수확하는 데 사용됩니다
수정된 Lohmann White Leghorn 알			수정란 이른 수정일에 가급적이면 수정 후 첫날에 하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 사용된 계란은 Michigan State University Poultry Farm에서 가져온 것입니다.
필터 겸자	EMD 밀리포어	#XX6200006P	달걀 껍질을 제거하는 데 사용되는 뭉툭한 집게
HBSS(1배)	지브코	#의 14025-092	Hank's Balanced Salt 솔루션
파라핀 왁스 멤브레인	파라필름 실험실 필름	#PM-996	8일차에 DRG 이식까지 난자 입구를 임시로 덮는 데 사용됩니다
PBS(1x) pH 7.4	지브코	#의 10010-023	인산염 완충 식염수
Tegaderm 투명 필름 드레싱	3엠	#9505W	멸균, 부화 중 계란 구멍을 덮는 데 사용되는 6x7cm

있습니다. . . .