miRNA 억제제를 사용한 종양내 치료 모델링: 쥐 모델에서 종양 성장에 대한 miRNA 억제제의 효과를 분석하는 방법

초록

출처: Ramirez-Moya, J. et al. 마우스의 종양 성장을 줄이기 위한 MicroRNA의 생체 내 억제. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 정소성 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 치료제로서 miRNA 억제제의 생체 내 전달을 보여줍니다. 합성 miRNA 억제제 또는 antagomiR의 종양 내 투여는 내인성 miRNA와 결합하고 억제할 수 있도록 하여 mRNA 상향 조절 및 종양 성장 억제를 유발합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 세포의 측면 접종 및 종양 내 antagomiR 치료

1. 세포 준비
   1. Cal62 인간 갑상선암 세포주(KRASG12R 및 p53A161D 돌연변이)를 설계하여 GFP 및 루시페라아제(CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP)를 구성적으로 발현하는 형질전환 구조를 과발현합니다. 항생제 내성 또는 유세포 분석으로 GFP 양성 세포를 분류하여 형질전환 세포를 선택합니다.
   2. 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 37°C 및 5% CO₂에서 세포를 성장시킵니다.
   3. 4°C에서 50μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 1 x 10⁶ 세포를 현탁합니다.
2. 마우스의 측면에 세포 접종
   1. 세포를 동일한 양의 기저막 매트릭스와 혼합합니다. 예를 들어, 50μL의 PBS에 있는 1 x 10⁶ 셀을 50μL의 기저막 매트릭스(재료 표 참조)에 추가하고 부드럽게 혼합합니다.
   2. 27G 1/2"(0.4x13mm) 바늘이 있는 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 6주 된 면역결핍 BALB/c nu/nu 마우스의 왼쪽 측면에 100μL의 샘플(PBS + 기저막 매트릭스의 세포)을 피
   하주사합니다.
3. 종양내 안타고미R 치료
   1. antagomiR(재료 표 참조) 또는 음성 대조군을 RNase가 없는 증류수 500μL에 현탁시킵니다.
   2. 주사 전에 각 주사에 대해 2 nmol의 antagomiR 또는 대조군을 in vivo 전달 시약(재료 표 참조)과 함께 준비합니다.
      1. 먼저 antagomiR 용액(재료 표 참조)과 착화 완충액(재료 표 참조)을 1:1 비율로 혼합합니다. 예를 들어, 80μL의 miRNA 억제제 용액(16nmol)을 80μL의 복합화 완충액(in vivo delivery reagent kit에 포함, 재료 표 참조)에 추가합니다.
      2. in vivo 전달 시약을 실온으로 가져옵니다. 1.5mL 튜브에 160μL를 넣고 즉시 160μL의 희석된 antagomiR 용액을 추가합니다. 남은 시약을 -20 °C로 되돌립니다. 필요한 경우 해동 후 최대 1주일 동안 시약을 4°C에서 보관하십시오.
      3. 즉시 (10 초) 소용돌이 (10 초) 생체 내 전달 시약-antagomiR의 복합화를 보장합니다.
      4. in vivo delivery reagent-antagomiR 혼합물을 50°C에서 30분 동안 배양합니다.튜브를 잠시 원심분리하여 샘플을 회수합니다.
      5. PBS pH 7.4 1360μL를 첨가하여 복합체를 6배 희석하고 잘 혼합합니다.
      6. 시약-antagomiR 복합체(8 마우스/조건)의 in vivo 전달을 진행하거나 주입 전 최대 1주일 동안 복합체를 4°C에서 보관하십시오. 각 종양에 200μL를 종양내로 주입합니다(antagomiR 2nmol).
         참고: antagomiR의 부피와 양은 종양 부피와 무관합니다.
   3. 2주 동안 매주 3회(월요일, 수요일, 금요일) 트리트먼트를 수행합니다.
4. 종양 성장 분석
   1. D-루시페린 기질의 40mg/mL 용액 50μL(재료 표 참조)를 27G 1/2"(0.4mm x 13mm) 바늘이 있는 1mL 주사기로 각 시점에서 피하주사합니다.
      1. 주사 후 8분에 산소와 혼합된 3% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 페달 반사(단단한 발가락 꼬집음)로 마취 수준을 평가하고 수술 평면을 유지하기 위해 적절하게 마취 전달을 조정합니다.
      2. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
5. 생체 내 이미징 소프트웨어를 사용하여 생물 발광 신호를 이미지화합니다(재료 표 참조).
   참고: 캘리퍼는 종양의 부피와 종양 성장을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다.
6. 생물 발광 신호를 얻으면 두 치료법을 비교하여 종양 성장을 분석하고 t-test를 사용하여 유의성을 결정합니다. 집단 내 분산을 분석하려면 SEM을 사용하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Basement Membrane Matrix: Matrigel 기저막 매트릭스 고농도	코 닝	#354248
AntagomiR: mirVana miRNA 억제제	써모 피셔	4464088	생체 내 지원
생체 내 전달 시약: Invivofectamine 3.0 시약	써모 피셔	체외수정 3005
음성 대조군: mirVana miRNA Inhibitor, 음성 대조군 #1	써모 피셔	4464077	생체 내 지원
XenoLight D-Luciferin - K+ 염 생물 발광 기판	퍼킨엘머	122799	PBS에서 희석되는
생체 내 이미징 소프트웨어: IVISLumina II 이미징 시스템	캘리퍼 생명 과학