아가로스 겔 방울에 3D 스페로이드 내장: 다운스트림 분석을 위해 스페로이드를 보존하는 기술

초록

출처: Rolver, M. G. et al. 암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존율 및 사멸 평가. J. Vis. 특급 (2019년)

이 동영상은 보존을 위해 아가로스 젤 방울에 3D 스페로이드를 삽입하는 기술에 대해 설명합니다. 내장된 3D 스페로이드는 다운스트림 분석에 추가로 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 3D 스페로이드 임베딩

1. 스페로이드가 내장된 아가로스 겔을 준비합니다(프로토콜을 처음 수행하는 경우에만 필요).
   1. 50mL의 ddH₂O에 bacto-agar 1g을 섞습니다.
   2. bacto-agar가 용해되고 균질한 젤이 형성될 때까지 전자레인지에서 천천히 가열합니다. 젤이 끓지 않도록 하십시오.
   3. bacto-agar를 60 ° C의 수조에서 따뜻하게 유지하십시오.
   4. 실험 사이에 4°C를 유지하십시오.
2. 스페로이드의 임베딩
   1. 1일차에는 각 조건에 대해 1.5mL 튜브에 최소 12개의 스페로이드를 풀링합니다.
   2. 얼음처럼 차가운 1X PBS 1mL로 한 번 씻으십시오.
   3. 스페로이드를 고정하려면 1mL의 4% 파라포름알데히드를 추가합니다.
      메모: 파라포름알데히드의 취급은 흄 후드에서 수행해야 합니다.
   4. RT에서 24시간 동안 배양하십시오.
   5. 2일차에는 아가로스 젤을 물을 채운 비커에 넣고 전자레인지에 넣어 조심스럽게 가열합니다. 젤이 끓지 않는지 확인하십시오. 사용할 때까지 60°C의 탁상용 가열판에서 따뜻하게 유지하십시오.
   6. 얼음처럼 차가운 1X PBS 1mL로 스페로이드를 두 번 세척합니다.
   7. 대부분의 1X PBS를 흡입합니다(이 시점에서 약 100μL를 남겨두는 것이 스페로이드를 처리하는 데 실용적입니다).
   8. 더 큰 구멍이 있는 더 뾰족한 팁을 얻기 위해 경사면에서 피펫 팁을 절단하여 20μL 피펫을 준비합니다(그림 1).
      참고: 최적의 스페로이드 전달을 보장하고 겔 방울의 응고를 방지하기 위해 다음 부분을 신속하게 수행해야 합니다. 가열 블록을 사용할 수 없는 경우 먼저 스페로이드를 잡은 다음 아가로스를 떨어뜨리는 것이 좋습니다(즉, 포인트 1.2.9 및 1.2.10의 순서 전환).
   9. 현미경 슬라이드에 아가로스 젤 방울을 만듭니다. 아가로스가 응고되는 것을 방지하기 위해 슬라이드를 따뜻한 가열 블록에 놓습니다.
   10. 변형된 피펫 팁(단계 1.2.8)을 사용하여 15–20 μL의 부피에서 가능한 한 많은 스페로이드를 포착합니다.
   11. 현미경 슬라이드를 건드리지 않고 15–20μL 스페로이드 함유 1X PBS를 아가로스 겔 드롭의 중앙에 조심스럽게 주입합니다.
       메모: 이것은 약간 어려운 점입니다. 스페로이드를 젤 드롭에 주입할 때 피펫 팁이 현미경 슬라이드에 닿으면 스페로이드가 손실됩니다. 아가로스 방울을 만들고 방울에 유색 액체를 주입하여 스페로이드를 주입하는 전 과정을 연습하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 착색된 액체가 슬라이드로 누출되므로 드롭을 통한 잠재적인 침투를 시각화
   할 수 있습니다.
   12. 아가로스 젤을 RT 또는 4 °C에서 5-10분 동안 배양하여 경화시킵니다. 젤 방울이 어느 정도 굳어지면(여전히 다소 부드럽습니다) 현미경 슬라이드의 젤 방울을 메스로 플라스틱 조직 카세트에 조심스럽게 밀어 넣습니다.
   13. 플라스틱 조직 카세트를 70% 에탄올로 덮습니다.
       메모: 이 시점에서 스페로이드는 직접 사용하거나 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
   14. 아가로스 포매 스페로이드를 파라핀에 삽입하고, 2-3μm 두께의 레이어 슬라이드로 절편화하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하거나 면역 조직학적 염색을 실시합니다.

결과

그림 1: 스페로이드의 고정, 포매 및 면역조직화학 분석.(A) 스페로이드 포매ing을 위한 프로토콜의 개략도. 개별 단계는 (i-vii)로 표시됩니다. (B) 임베디드 MDA-MB-231 스페로이드 이미지. 스케일 바: 50 μm. (C) p-53에 대한 항체와 함께 IHC 분석을 실시한 화학요법 처리된 MDA-MB-231 스페로이드의 대표 이미지. 점선은 타원체의 둘레를 나타냅니다. 스케일 바 = 20 μm. (D, E) DMSO- 또는 화학 요법 처리 (각각 상단 및 하단 패널) MDA-MB-231 스페로이드의 대표 이미지. MDA-MB-231...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박토아가르	BD 생명과학	#214010	아가로스 젤 준비에 사용
포름알데히드	VWR 화학 물질	#의 9713.1000	세포 고정에 사용
Medim Uni-safe 카제트	메딤 역사공학자	제10-0114	내장된 스페로이드의 보관에 사용
Superfrost Ultra-Plus 접착 슬라이드	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	임베딩에 사용되는 현미경 유리 슬라이드
CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석	프로메가	#G9681	세포 생존율 분석에 사용

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