생쥐 모델에서 세포외 기질의 제작: 쥐 혀에서 탈세포화된 혀 세포외 기질을 준비하는 효과적인 절차

초록

출처: Yao, Y. et al. 혀 세포 외 기질의 제작 및 혀 편평 세포 암종의 재구성 in vitro. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 채취한 혀를 일련의 물리적, 화학적, 효소적 처리에 노출시키는 탈세포화 방법을 사용하여 쥐의 혀 세포 외 기질을 준비하는 방법을 보여줍니다. 그 결과 생성된 TEM 골격은 고유한 세포외 기질 구성을 유지하여 세포 구성 요소를 제거합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 혀 세포 외 기질(TEM)의 준비

1. 경추 탈구로 생쥐를 처형하고 멸균 수술용 가위와 핀셋을 사용하여 혀를 제거합니다.
2. 혀를 75% 에탄올에 3분 동안 담근 다음 각 혀를 10mM 멸균 인산염 완충 용액(PBS) 1mL와 함께 1.5mL Eppendorf(EP) 튜브에 넣습니다.
   메모: 다음 모든 단계에서 PBS의 농도는 이 단계의 농도와 동일합니다.
3. 동결-해동에 의한 세포 용해: EP 튜브의 혀를 -80°C에서 1시간 동안 동결한 다음 실온에서 45분 동안 3사이클 동안 혀를 해동합니다.
4. 수술용 바늘을 사용하여 각 혀를 수술용 봉합사 조각에 넣고 봉합사 끝을 작은 멸균 은박지 조각으로 감쌉니다. 멸균 상태에서 3.5% 에탄올이 함유된 6cm 또는 75cm 배양 접시에서 작업을 수행합니다.
   메모: 각 외과용 봉합사 조각의 적절한 길이는 약 20cm이고 각 은박지 조각의 적절한 크기는 약 0.3cm²(1cm x 0.3cm)입니다. 혀는 은박지 근처에 넣어야 합니다.
5. 3.5cm 또는 6cm 배양 접시에 3mL의 멸균 PBS로 각 혀를 30초 동안 헹굽니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행합니다.
6. 초순수로 혀를 씻으십시오 : 250mL의 멸균 초순수와 함께 입이 넓은 병에 암피실린을 최종 농도 90μg / mL까지 첨가하십시오. 젓는 막대가 들어 있는 병에 혀를 넣습니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행합니다.
   메모: 봉합사의 꼬임을 고려하여 같은 병에 최대 5개의 혀를 넣을 수 있습니다. 은박지는 혀가 미끄러지는 것을 방지하기 위해 병의 봉합사 끝에 있습니다. 혀는 병 내부에 남아 있는 봉합사의 길이를 조정하여 병 바닥에서 2cm 높이에 위치해야 합니다. 이 참고 사항은 1.8, 1.10, 1.12 및 1.16단계에도 적용됩니다.
7. 병을 자석 교반기에 12 시간 동안 올려 놓습니다.
8. NaCl로 혀를 씻으십시오 : 250mL의 멸균 1M NaCl과 함께 암피실린을 90μg / mL의 최종 농도로 입구가 넓은 병에 첨가하십시오. 혀와 젓는 막대를 병 안으로 옮깁니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행하십시오.
9. 병을 자석 교반기에 24 시간 동안 올려 놓습니다.
10. Triton X-100에 의한 세포 용해: PBS에 250mL의 멸균 2% Triton X-100이 함유된 입구가 넓은 병에 암피실린을 최종 농도 90μg/mL로 첨가합니다. 혀와 젓는 막대를 병 안으로 옮깁니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행하십시오.
11. 병을 자석 교반기에 48 시간 동안 올려 놓습니다.
12. CaCl₂/MgCl₂로 혀 세척: 250mL의 멸균 5mM CaCl₂/MgCl₂가 있는 입이 넓은 병에 암피실린을 최종 농도 90μg/mL까지 추가합니다. 혀와 젓는 막대를 병 안으로 옮깁니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행하십시오.
13. 병을 자석 교반기에 24 시간 동안 올려 놓습니다.
14. DNase에 의한 분해: 각 EP 튜브에 Hank's balanced salt solution(HBSS) 1mL를 추가합니다. DNase를 HBSS에 각각 최종 농도 300μM까지 추가합니다. 봉합사의 일부가 튜브 외부로 오도록 각 혀를 각 EP 튜브로 이동합니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행합니다.
    메모: 이전 단계에서 병 내부에 남아 있는 봉합사 부분이 이 단계에서 EP 튜브 내부에도 남아 있는지 확인하고, 이전 단계에서 병 외부에 남아 있는 봉합사 부분이 이 단계에서 EP 튜브 외부에도 남아 있는지 확인합니다.
15. EP 튜브의 혀를 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
16. PBS로 혀를 씻으십시오 : 250mL의 멸균 PBS와 함께 암피실린을 90 μg / mL의 최종 농도로 입구가 넓은 병에 첨가하십시오. 혀와 젓는 막대를 병 안으로 옮깁니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행하십시오.
17. 병을 자석 교반기에 24 시간 동안 올려 놓습니다.
18. 준비된 TEM을 사용할 때까지 4°C의 멸균 PBS에 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57-BL/6J 마우스	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center (국부원 대학교 실험실 동물 센터)
에탄올	광저우 화학 시약 공장	HB15-GR-2.5L
소금	(주)상곤바이오텍	A501218
이염기성 인산나트륨	광저우 화학 시약 공장	BE14-GR-500G
인산칼륨 일염기성	(주)상곤바이오텍	A501211
1.5mL EP 튜브	액시겐	MCT-150-A
초저온 냉동고	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific
3.5cm 세포 배양 접시	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	153066
6cm 세포 배양 접시	그라이너	628160
트리톤 X-100	시그마-알드리치	V900502
염화칼슘	시그마-알드리치	746495
염화마그네슘	시그마-알드리치	449164
DNase	시그마-알드리치	D5025
암피실린	시그마-알드리치	A9393
외과용 봉합사	상하이 진환(鵷海都
250mL 입이 넓은 병	슈니우	1407
자석 교반기	하나로	제1-4602-32
이산화탄소 인큐베이터	쉘 랩	SCO5A
정수기	엘가
헤페스 유리산	비	A600264
4 °C 냉장고	하이얼

) ) 년 년 호