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동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 혀 세포 외 기질(TEM)의 준비
- 경추 탈구로 생쥐를 처형하고 멸균 수술용 가위와 핀셋을 사용하여 혀를 제거합니다.
- 혀를 75% 에탄올에 3분 동안 담근 다음 각 혀를 10mM 멸균 인산염 완충 용액(PBS) 1mL와 함께 1.5mL Eppendorf(EP) 튜브에 넣습니다.
메모: 다음 모든 단계에서 PBS의 농도는 이 단계의 농도와 동일합니다.
- 동결-해동에 의한 세포 용해: EP 튜브의 혀를 -80°C에서 1시간 동안 동결한 다음 실온에서 45분 동안 3사이클 동안 혀를 해동합니다.
- 수술용 바늘을 사용하여 각 혀를 수술용 봉합사 조각에 넣고 봉합사 끝을 작은 멸균 은박지 조각으로 감쌉니다. 멸균 상태에서 3.5% 에탄올이 함유된 6cm 또는 75cm 배양 접시에서 작업을 수행합니다.
메모: 각 외과용 봉합사 조각의 적절한 길이는 약 20cm이고 각 은박지 조각의 적절한 크기는 약 0.3cm2(1cm x 0.3cm)입니다. 혀는 은박지 근처에 넣어야 합니다.
- 3.5cm 또는 6cm 배양 접시에 3mL의 멸균 PBS로 각 혀를 30초 동안 헹굽니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행합니다.
- 초순수로 혀를 씻으십시오 : 250mL의 멸균 초순수와 함께 입이 넓은 병에 암피실린을 최종 농도 90μg / mL까지 첨가하십시오. 젓는 막대가 들어 있는 병에 혀를 넣습니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행합니다.
메모: 봉합사의 꼬임을 고려하여 같은 병에 최대 5개의 혀를 넣을 수 있습니다. 은박지는 혀가 미끄러지는 것을 방지하기 위해 병의 봉합사 끝에 있습니다. 혀는 병 내부에 남아 있는 봉합사의 길이를 조정하여 병 바닥에서 2cm 높이에 위치해야 합니다. 이 참고 사항은 1.8, 1.10, 1.12 및 1.16단계에도 적용됩니다.
- 병을 자석 교반기에 12 시간 동안 올려 놓습니다.
- NaCl로 혀를 씻으십시오 : 250mL의 멸균 1M NaCl과 함께 암피실린을 90μg / mL의 최종 농도로 입구가 넓은 병에 첨가하십시오. 혀와 젓는 막대를 병 안으로 옮깁니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행하십시오.
- 병을 자석 교반기에 24 시간 동안 올려 놓습니다.
- Triton X-100에 의한 세포 용해: PBS에 250mL의 멸균 2% Triton X-100이 함유된 입구가 넓은 병에 암피실린을 최종 농도 90μg/mL로 첨가합니다. 혀와 젓는 막대를 병 안으로 옮깁니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행하십시오.
- 병을 자석 교반기에 48 시간 동안 올려 놓습니다.
- CaCl2/MgCl2로 혀 세척: 250mL의 멸균 5mM CaCl2/MgCl2가 있는 입이 넓은 병에 암피실린을 최종 농도 90μg/mL까지 추가합니다. 혀와 젓는 막대를 병 안으로 옮깁니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행하십시오.
- 병을 자석 교반기에 24 시간 동안 올려 놓습니다.
- DNase에 의한 분해: 각 EP 튜브에 Hank's balanced salt solution(HBSS) 1mL를 추가합니다. DNase를 HBSS에 각각 최종 농도 300μM까지 추가합니다. 봉합사의 일부가 튜브 외부로 오도록 각 혀를 각 EP 튜브로 이동합니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행합니다.
메모: 이전 단계에서 병 내부에 남아 있는 봉합사 부분이 이 단계에서 EP 튜브 내부에도 남아 있는지 확인하고, 이전 단계에서 병 외부에 남아 있는 봉합사 부분이 이 단계에서 EP 튜브 외부에도 남아 있는지 확인합니다.
- EP 튜브의 혀를 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- PBS로 혀를 씻으십시오 : 250mL의 멸균 PBS와 함께 암피실린을 90 μg / mL의 최종 농도로 입구가 넓은 병에 첨가하십시오. 혀와 젓는 막대를 병 안으로 옮깁니다. 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 병 뚜껑을 조입니다. 멸균 상태에서 이 작업을 수행하십시오.
- 병을 자석 교반기에 24 시간 동안 올려 놓습니다.
- 준비된 TEM을 사용할 때까지 4°C의 멸균 PBS에 보관하십시오.