방법 논문

탈세포화된 조직의 크라이오밀링: 미세한 세포외 기질 분말을 얻는 기술

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Kornmuller, A. et al. 조직 특이적 세포 배양 및 전달 플랫폼으로서의 세포 외 기질 유래 폼 및 마이크로캐리어 제작. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오에서는 cryomilling을 통해 동결건조된 탈세포화된 조직에서 미세하게 분쇄된 세포외 기질 분말을 얻는 프로토콜을 제시합니다. 분말 ECM은 생화학적 조성을 유지하며 마이크로캐리어 합성에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

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1. 탈세포화된 조직 처리

  1. 탈세포화(Decellularization)와 동결건조(Lyophilization)
    1. 확립된 프로토콜에 따라 관심 조직을 탈세포화합니다.
      메모: 현재 연구에서 골격은 인간 DAT, 돼지 DDT 및 돼지 DLV에 대해 발표된 탈세포화 프로토콜에 따라 준비되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 불용성 콜라겐은 10–50 mg/mL의 농도 범위에서 성공적으로 사용된 소 힘줄에서 추출한 콜라겐과 같은 폼 및 마이크로캐리어를 제조하는 데에도 사용할 수 있습니다. 다른 불용성 콜라겐 공급원을 사용할 수 있지만 안정적인 골격을 생성할 농도 범위를 식별하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다.
    2. 수화된 탈세포화된 조직 또는 정제된 콜라겐을 집게로 50mL 원심분리 튜브에 옮기고 충분한 이중 증류수(ddH₂O)를 추가하여 조직을 담글 수 있도록 최대 총 부피 35mL까지 넣습니다.
    3. -80°C에서 하룻밤 동안 샘플을 동결하고, 동결 중에 원심분리기 튜브를 수평으로 배치하여 후속 동결 건조 시 승화를 위한 표면적을 최대화합니다.
    4. 원심분리기 튜브에서 캡을 제거하고 냉동 샘플을 동결 건조 용기에 옮깁니다.
    5. 실험실 동결 건조기를 사용하여 48–72시간 동안 또는 완전히 건조될 때까지 샘플을 동결건조합니다.
      메모: 건조 시간은 동결 건조기와 탈세포화된 조직에 따라 다를 수 있습니다.
    6. 날카로운 수술 용 가위를 사용하여 동결 건조 된 ECM을 작은 조각 (~ 1-2 mm3)으로 잘게 다집니다.
    7. 추가 처리가 준비될 때까지 다진 ECM을 건조기에 보관하십시오.
      메모: 다진 ECM은 환경으로부터 수분 흡수를 방지하기 위해 즉시 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 크라이오밀링(폼 제작을 위한 옵션)
    1. 실험실 볼 밀 시스템용 25mL 스테인리스강 밀링 챔버에 다진 동결건조 ECM을 채우고 10mm 스테인리스강 밀링 볼 2개를 추가합니다.
    2. 적재된 밀링 챔버를 닫고 3분 동안 액체 질소에 완전히 담그십시오.
    3. 얼어붙은 샘플을 30Hz(1,800rpm)에서 3분 동안 밀링합니다.
    4. ECM이 미세한 가루로 밀링될 때까지 1.2.2 및 1.2.3 단계를 반복합니다.
      메모: 이러한 단계를 반복해야 하는 횟수는 ECM 소스마다 다를 수 있습니다. 예를 들어, DAT는 일반적으로 미세한 분말을 생성하기 위해 3번의 밀링 주기가 필요합니다.
    5. 스쿠큘라를 사용하여 분말을 유리 바이알에 옮기고 단단히 밀봉한 다음 데시케이터에 보관합니다.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
앨리게이터 클립 리드폭스바겐제470149-728
알루미늄 호일피셔 사이언티픽01-213-101
분석 저울싸토리우스CPA225D
크라이오밀링 시스템레치20.745.0001밀리미터 400
데시케이터피셔 사이언티픽8624426동결건조된 ECM 및 바이오스캐폴드 보관용
듀어 플라스크피셔 사이언티픽10-196-6낮은 형태, 250 - 500 mL의 부피 범위
이중 증류수(ddH2O)Barnstead GenPure xCAD 정수 시스템 제공
ECM (세포외 기질)Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 및 Wainwright et al. 2010에 설명된 바와 같이 인간 지방 조직, 돼지 진피 또는 돼지 심근에서 분리
집게폭스바겐Tel.: 37-501-32거품 이동을 위해
냉동고 (-20 °C)폭스바겐97043-346
냉동고 (-80 °C)써모 사이언티픽(Thermo ScientificEXF40086A
유리병(glass vial)피셔 사이언티픽03-339-26일동결건조된 크라이오밀링된 ECM을 보관하기 위해
액체 질소전기 분무용
동결건조기랩콘코7750021프리존4.5
밀링 챔버레치02.462.021325mL 용량 권장
밀링 볼폭스바겐제16003-606직경 10mm, 스테인리스강 권장
페니실린-스트렙토마이신생명 기술15140-122증식 매체에 사용
피펫 에이드 XP만델 사이언티픽DRU-4-000-101
스쿠풀라폭스바겐89259-968마이크로캐리어 수집용
수술용 가위폭스바겐82027-590
호 년 ) 호 년 년 년

재인쇄 및 허가

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태그

ECM

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