ECM 현탁액 제제: 조직 유래 세포외 기질에서 균질한 현탁액을 얻는 기술

초록

출처: Kornmuller, A. et al. 조직 특이적 세포 배양 및 전달 플랫폼으로서의 세포외 매트릭스 유래 폼 및 마이크로캐리어 제작. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 탈세포화 및 동결건조된 조직에서 균질화 및 소화된 세포외 기질 현탁액의 준비에 대해 설명합니다. 이 기술은 고급 3D 세포 배양 모델에서 기질로 사용하기 위해 ECM 유래 다공성 폼 및 마이크로캐리어를 제조하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 탈세포화된 조직 처리

1. 탈세포화(Decellularization)와 동결건조(lyophilization)
   1. 확립된 프로토콜에 따라 관심 조직을 탈세포화합니다.
      메모: 현재 연구의 골격은 인간 탈세포화된 지방 조직(DAT), 돼지 탈세포화된 피부 조직(DDT) 및 돼지 탈세포화된 좌심실(DLV)에 대해 발표된 탈세포화 프로토콜에 따라 준비되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 불용성 콜라겐은 10–50 mg/mL의 농도 범위에서 성공적으로 사용된 소 힘줄에서 추출한 콜라겐과 같은 폼 및 마이크로캐리어를 제조하는 데에도 사용할 수 있습니다. 다른 불용성 콜라겐 공급원을 사용할 수 있지만 안정적인 골격을 생성할 농도 범위를 식별하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다.
   2. 수화된 탈세포화된 조직 또는 정제된 콜라겐을 겸자로 50mL 원심분리 튜브에 옮기고 충분한 이중 증류수(ddH₂O)를 추가하여 조직을 최대 총 부피 35mL까지 담궈냅니다.
   3. -80°C에서 하룻밤 동안 샘플을 동결하고, 동결 중에 원심분리기 튜브를 수평으로 배치하여 후속 동결 건조 시 승화를 위한 표면적을 최대화합니다.
   4. 원심분리기 튜브에서 캡을 제거하고 냉동 샘플을 동결 건조 용기에 옮깁니다.
   5. 실험실 동결 건조기를 사용하여 48–72시간 동안 또는 완전히 건조될 때까지 샘플을 동결건조합니다.
      메모: 건조 시간은 동결 건조기와 탈세포화된 조직에 따라 다를 수 있습니다.
   6. 날카로운 수술 용 가위를 사용하여 동결 건조 된 ECM을 작은 조각 (~ 1-2mm³)으로 잘게 다집니다.
   7. 추가 처리가 준비될 때까지 다진 ECM을 건조기에 보관하십시오.
      메모: 다진 ECM은 환경으로부터 수분 흡수를 방지하기 위해 즉시 사용하는 것이 좋습니다.
2. 크라이오밀링
   1. 실험실 볼 밀 시스템용 25mL 스테인리스강 밀링 챔버에 다진 동결건조 ECM을 채우고 10mm 스테인리스강 밀링 볼 2개를 추가합니다.
   2. 적재된 밀링 챔버를 닫고 3분 동안 액체 질소에 완전히 담그십시오.
   3. 냉동 샘플을 30Hz(1,800rpm)에서 3분 동안 미세한 분말로 밀링합니다.
      메모: 이러한 단계를 반복해야 하는 횟수는 ECM 소스마다 다를 수 있습니다. 예를 들어, DAT는 일반적으로 미세한 분말을 생성하기 위해 3번의 밀링 주기가 필요합니다.
3. ECM 현탁액 준비
   1. 다진 ECM(폼의 경우) 또는 극저밀링된 ECM(폼 또는 마이크로캐리어의 경우) ECM 250mg의 무게를 측정하고 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다진 ECM 및 크라이오밀링된 ECM의 준비는 각각 1.1.6단계 및 섹션 1.2를 참조하십시오.
      메모: 이 프로토콜은 인간 DAT, 돼지 DDT 및 돼지 DLV에 권장되는 50mg/mL ECM 현탁액을 준비하도록 설계되었습니다. 특정 ECM 소스에 따라 더 높거나 더 낮은 시작 농도에서 균일한 현탁액이 생성될 수 있습니다.
   2. 원심분리기 튜브에 0.22 M NaH₂PO₄ (pH 5.4) 완충액 5 mL를 추가하고 튜브에 액체 레벨을 표시합니다.
   3. 1mL 0.22 M NaH₂PO₄ (pH 5.4) 완충액에 α-아밀라제 7.5 mg을 첨가하여 α-아밀라제 원액을 준비합니다. α-아밀라아제 원액 100μL(α-아밀라제 0.75mg: 건조 조직 0.3% w/w)를 샘플에 추가합니다. 0.22 M NaH₂PO₄ 를 첨가하여 10 mL의 최종 부피를 얻는다.
   4. 실온에서 300시간 동안 72rpm으로 서스펜션을 계속 교반합니다.
   5. 1,500 x g에서 10분 동안 현탁액을 원심분리하고, 분해된 ECM 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 수집하여 폐기합니다. 펠릿화된 물질을 ddH₂O에 희석된 5% NaCl 10mL에 재현탁합니다.
   6. ddH₂O에 5% NaCl로 총 2번의 헹굼에 대해 1.3.5단계를 반복합니다.
   7. 상등액을 버리고 펠릿화된 물질을 10mL의 ddH₂O에 재현탁합니다.
   8. RT에서 300분 동안 10rpm으로 서스펜션을 계속 교반합니다.
   9. 1,500 x g에서 10분 동안 현탁액을 원심분리하고, 분해된 ECM 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 수집하여 폐기합니다.
   10. 1.3.2단계에서 만든 5mL 표시에 0.2M 아세트산을 추가합니다.
   11. 37°C에서 120rpm O/N으로 서스펜션을 계속 교반합니다.
   12. 눈에 보이는 파편이 남지 않을 때까지 톱니 10mm 너비의 프로브가 장착된 휴대용 균질화기를 사용하여 10초 간격으로 실온에서 ECM 현탁액을 균질화합니다. 과열을 방지하기 위해 균질화 간격 사이에 현탁액을 찬물이 담긴 비이커에 넣습니다.
       메모: ECM 소스에 따라 균일한 현탁액을 얻기 위해 0.2M 아세트산을 추가로 희석해야 할 수 있습니다. ECM 현탁액을 과도하게 냉각하면 점도가 증가하여 효율적인 균질화를 방해할 수 있습니다. 점도 증가가 감지되면 샘플을 37°C로 재가열하고 추가 처리를 수행할 수 있습니다.
   13. 폼 또는 마이크로캐리어 제작 전에 최대 한 달 동안 4°C에서 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세트산, 빙하	바이오샵	에이스222.5
α-아밀라아제	시그마	101074694	Aspergillus aryzae에서
원심분리기 75004251	써모 사이언티픽(Thermo Scientific		15 및 50 mL 원심분리기 튜브용 스윙 버킷 로터 포함
원심분리기 튜브(15mL)	사르슈테트	62.554.205
데시케이터	피셔 사이언티픽	8624426	동결건조된 ECM 및 바이오스캐폴드 보관용
이중 증류수(ddH2O)			Barnstead GenPure xCAD 정수 시스템 제공
ECM (세포외 기질)			문헌[Flynn et al. 2010], Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)에 기술된 바와 같이, 인간 지방 조직, 돼지 진피 또는 돼지 심근으로부터 분리
휴대용 균질화기	피셔 사이언티픽	Tel.: 14-359-251	속도: 8,000 - 30,000 rpm
균질화기 부속품: 톱니 바닥 발전기 프로브	피셔 사이언티픽	제14-261-17	10 x 95 밀리미터
액체 질소
소금	바이오샵	7647-14-5
인산나트륨 일염기성	바이오샵	10049-21-5
수술용 가위	폭스바겐	82027-590

) 됨 호 년 년