동결 건조를 통한 세포외 매트릭스 유래 폼 제작: 탈세포화된 조직의 ECM에서 생물학적 골격을 생성하는 절차

초록

출처: Kornmuller, A. et al. 조직 특이적 세포 배양 및 전달 플랫폼으로서의 세포 외 매트릭스 유래 폼 및 마이크로캐리어 제작. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오는 화학적 가교 없이 순수한 ECM 유래 폼을 합성하는 방법을 설명합니다. 이러한 ECM 유래 폼은 고급 3D 체외 세포 배양 모델 또는 재생 바이오스캐폴드로 사용됩니다.

프로토콜

1. ECM 유래 폼 제작

1. ECM 미세 분말을 완충 용액에 분산시켜 균질한 ECM 현탁액을 준비하고 현탁액이 따뜻해질 때까지 120rpm에서 연속 교반하면서 37°C에서 배양합니다.
2. ECM 현탁액을 0.2M 아세트산으로 원하는 농도로 희석합니다.
   메모: ECM 소스에 따라 10–100 mg/mL 범위에서 안정적인 폼을 준비할 수 있으며, DAT, DDT 및 DLV에 권장되는 범위는 15–50 mg/mL입니다. 일반적으로 더 높은 농도로 제작된 폼은 다공성이 약간 낮지만 배양이 더 안정적이고 취급이 더 쉽습니다.
3. ECM 현탁액에서 기포 형성을 방지하기 위해 18G 바늘이 있는 3mL 주사기를 사용하여 원하는 금형에 ECM 현탁액을 채웁니다. DAT, DDT 및 DLV 폼을 제조하려면 400μL의 35mg/mL ECM 현탁액을 48웰 세포 배양 처리된 플레이트에 분주합니다.
   메모: 선택한 금형의 모양과 ECM 현탁액의 부피에 따라 결과 폼의 형상이 결정됩니다.
4. -20 °C 또는 -80 °C 냉동고에 넣어 금형을 덮고 밤새 얼립니다.
   메모: 동결 온도는 거품의 다공성에 영향을 줄 수 있습니다. 샘플이 -80°C에서 동결될 때 더 큰 얼음 결정이 형성되기 때문에 -80°C에 비해 -20°C에서 동결될 때 더 큰 기공이 예상됩니다. 균일한 다공성 구조의 폼을 제작하려면 방향성 냉각을 방지하기 위해 금형이 전도성 표면과 접촉하지 않도록 하십시오.
5. 냉동 샘플이 들어있는 주형을 동결 건조기 플라스크에 넣습니다. 동결 건조기 플라스크를 실험실 동결 건조기 시스템에 연결하고 24시간 동안 건조
   참고: 동결 건조 전에 샘플을 냉동 상태로 유지하는 것이 중요합니다.
6. 동결건조된 폼은 필요할 때까지 건조기에 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
분석 저울	싸토리우스	CPA225D
원심분리기 튜브(15mL)	사르슈테트	62.554.205
원심분리기 튜브(50mL)	사르슈테트	62.547.205
소 아킬레스건에서 추출한 콜라겐 힘줄 (불용성)	시그마	C9879	또는 유사한 불용성 콜라겐 근원; 로 사용할 수 있습니다. decellularized 의 대안 거품을 날조하는 조직 및 마이크로캐리어
데시케이터	피셔 사이언티픽	8624426	동결건조된 ECM 및 용 bioscaffold 저장
듀어 플라스크	피셔 사이언티픽	10-196-6	낮은 형태, 250 -500 mL의 부피 범위
이중 증류수(ddH_{2} O)			Barnstead GenPure xCAD 부터 정수 시스템
D-PBS(인산염 완충 식염수)	들소	311425125
ECM (세포외 기질)			인간 adipose 로부터 격리 조직, 돼지 진피 또는 돼지 Flynn 에 설명된 심근 et al. 2010, Reing et al. 2010 및 Wainwright et al. 2010 (참조 # 28, 8, 32)
집게	폭스바겐	Tel.: 37-501-32	거품 이동을 위해
냉동고 (-20 °C)	폭스바겐	97043-346
냉동고 (-80 °C)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	EXF40086A
유리병(glass vial)	피셔 사이언티픽	03-339-26일	동결건조된 cryomilled 보관하기 위해 ECM (영어
액체 질소			전기 분무용
동결건조기	랩콘코	7750021	프리존4.5
18 G 바늘	폭스바겐	C ABD305185	ECM 서스펜션 디스펜싱용 금형으로
오비탈 인큐베이터 쉐이커	실로젝스	832010089999	온도 제어(37°C)
혈청학적 피펫(10mL)	사르슈테트	86.1254.001
혈청학적 피펫(25 mL)	사르슈테트	86.1685.001
소금	바이오샵	7647-14-5
인산나트륨 일염기성	바이오샵	10049-21-5

년 ) ) 년