전기분무에 의한 바이오스캐폴드 제작: 탈세포화된 조직의 세포외 기질에서 파생된 마이크로캐리어 스캐폴드를 생성하는 기술

초록

출처: Kornmuller, A. et al. 조직 특이적 세포 배양 및 전달 플랫폼으로서의 세포외 매트릭스 유래 폼 및 마이크로캐리어 제작. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 전기 분무에 의한 세포 외 기질 유래 마이크로캐리어 제조 절차를 보여줍니다. 이러한 마이크로캐리어는 네이티브 조직 특이적 미세환경을 시뮬레이션하며 장기 3D 체외 세포 배양 모델에서 안정적입니다.

프로토콜

1. 전기 분무를 통한 ECM 유래 마이크로캐리어 제작

>참고: 전기 분무 설정에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 이전에 준비된 크라이오밀링된 ECM 현탁액을 37°C에서 100rpm O/N.
   에서 연속 교반으로 배양합니다. 메모: 크라이오밀링된 ECM은 ECM 유래 마이크로캐리어를 제작하는 데 사용되어 현탁액의 균일성을 높이고 전기 분무 중 막힘을 방지합니다.
2. 3mL Luer-Lock 주사기에 ECM 현탁액 3mL를 로드하고 날개 달린 주입 세트를 주사기 구멍에 부착합니다.
   메모: 다양한 바늘 게이지를 사용할 수 있으며, 선택이 결과 마이크로캐리어의 크기와 모양에 영향을 미칠 수 있음을 인식합니다. DAT, DDT, DLV 마이크로캐리어를 제작하려면 25G 바늘을 사용하십시오.
3. 주사기 펌프 내에 주사기를 고정합니다. 바늘을 레토르트 스탠드에 고정하고 바늘 끝을 낮은 형태의 듀어 플라스크 상단에서 4-6cm 떨어진 곳에 수직으로 배치합니다(250–500mL 크기 범위 권장).
4. 바늘 끝에 악어 클립 전극을 부착하고 고전압 전원 공급 장치의 양극 단자에 연결합니다.
5. 진공 플라스크의 가장자리에 알루미늄 호일(12 x 5cm) 스트립을 접습니다.
6. 호일의 바깥쪽 가장자리에 두 번째 악어 클립 전극을 부착하고 전원 공급 장치의 접지 소스 단자에 연결합니다.
7. 호일의 3/4이 잠기도록 상단에서 약 1cm 떨어진 곳까지 듀어 플라스크에 액체 질소를 채웁니다.
   메모: 듀어 플라스크에 액체 질소를 채우는 것이 중요합니다. 액체 질소의 표면은 전기 분무 과정에서 플라스크 상단에서 2cm 이상 떨어져 있지 않아야 합니다. 전기 분무 중 일정한 수준을 유지하기 위해 액체 질소를 지속적으로 보충해야 합니다.
8. 주사기 펌프를 주입 속도를 30mL/h로 설정합니다.
   메모: 주입 속도를 변경하면 마이크로캐리어 모양과 직경이 변경될 수 있지만 권장 범위는 25–35mL/h입니다. 현탁액의 점도에 크게 의존하지만 유속이 25mL/h 미만이면 더 큰 마이크로캐리어가 생성될 수 있습니다. 매우 낮은 유속에서는 마이크로캐리어의 크기와 모양이 덜 균질해질 수 있습니다. 35mL/h 이상의 주입 속도에서는 전기 분무를 통해 생성된 액적의 균일성이 중단되어 더 넓은 크기 분포를 가진 비구형 마이크로캐리어가 생성될 수 있습니다.
9. 20kV의 전압을 적용하고 주사기 펌프를 켜서 전기 스프레이를 시작합니다.
   메모: 전압은 마이크로캐리어의 크기를 조정하기 위해 변경될 수 있으며 주입 속도보다 직경에 더 큰 영향을 미치는 경향이 있습니다. 권장 전압 범위는 15–25kV입니다. 전압 증가에 따라 마이크로캐리어 직경의 감소가 예상됩니다.
10. 주입이 완료되면 Dewar에서 과도한 액체 질소를 조심스럽게 붓고 마이크로캐리어를 ~25mL의 액체 질소에 매달려 냉동 상태로 유지합니다.
11. 액체 질소가 포함된 마이크로캐리어를 한 번의 부드러운 동작으로 부어 50mL 원심분리기 튜브로 즉시 옮깁니다. 스쿠퓰라로 듀어에 남아 있는 얼어붙은 마이크로캐리어를 모두 모아 원심분리기 튜브에 넣습니다.
    메모: Dewar의 크기에 따라 액체 질소의 마이크로캐리어를 처음에는 중간 크기의 용기에 부은 다음 즉시 50mL 원심분리 튜브로 옮길 수 있습니다.
12. 액체 질소에 마이크로캐리어가 들어 있는 원심분리기 튜브를 동결 건조를 준비하기 위해 작은 구멍이 뚫린 알루미늄 호일로 덮습니다.
13. 뚜껑이 있는 원심분리기 튜브를 동결 건조기 플라스크에 넣습니다. 즉시 플라스크를 동결 건조기에 연결하고 샘플을 건조시킵니다.amp르 O/N.
    메모: 마이크로캐리어를 액체 질소에 부유시켜 이 단계 전에 해동되지 않도록 하는 것이 매우 중요한데, 해동으로 인해 붕괴 및/또는 응집이 발생할 수 있습니다. 위에서 설명한 전기 분무 조건을 사용하여 35mg/mL의 농도로 제조된 DAT, DDT 및 DLV 마이크로캐리어는 일반적으로 350–500μm 크기의 수화 직경을 갖습니다. 크기 분포는 ECM 소스에 따라 달라질 수 있습니다.
14. 동결건조된 마이크로캐리어는 필요할 때까지 건조기에 보관합니다.

결과

그림 1. 마이크로캐리어 제작에 사용되는 전기 분무 장치의 개요. A: 주사기 펌프 및 고전압 전원 공급 장치를 포함한 주요 전기 분무 장비의 배치와 액체 질소의 듀어에 대한 바늘의 위치를 보여주는 이미지. B: 전압, 주입 속도에 대한 권장 범위를 포함한 전기 분무 회로도, 그리고 거리.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
앨리게이터 클립 리드	폭스바겐	제470149-728
알루미늄 호일	피셔 사이언티픽	01-213-101
원심분리기 튜브(15mL)	사르슈테트	62.554.205
원심분리기 튜브(50mL)	사르슈테트	62.547.205
데시케이터	피셔 사이언티픽	8624426	동결건조된 ECM 및 바이오스캐폴드 보관용
듀어 플라스크	피셔 사이언티픽	10-196-6	낮은 형태, 250 - 500 mL의 부피 범위
ECM (세포외 기질)			문헌[Flynn et al. 2010], Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)에 기술된 바와 같이, 인간 지방 조직, 돼지 진피 또는 돼지 심근으로부터 분리
액체 질소			전기 분무용
동결건조기	랩콘코	7750021	프리존4.5
오비탈 인큐베이터 쉐이커	실로젝스	8.3201E+11	온도 제어(37°C)
레토르트 스탠드	폭스바겐	제470019-526
레토르트 스탠드 클램프	폭스바겐	21573-606
Safety-Lok 주사기	BD (영어)	309606	마이크로캐리어 제작 및 ECM 현탁액을 위한 3 mL Luer Lock 시린지
스쿠풀라	폭스바겐	89259-968	마이크로캐리어 수집용
주사기 펌프	폭스바겐	제10117-490	제어되는 마이크로프로세서
고전압 전원 공급 장치	감마 고전압 연구	ES30P-5W/DDPM	권장 15 - 25kV 전압 범위 가능
날개 달린 주입 세트	테루모	22258092	30cm 튜브 길이, 25G 3/4" 권장; 다른 니들 게이지를 사용할 수 있으며 마이크로캐리어 직경에 영향을 줄 수 있습니다.