쥐 등뿌리 신경절과 암세포의 3차원 공동 배양 모델 구축: 신경주위 암세포 침입을 연구하기 위한 체외 모델

초록

출처: Huyett, P. et al. 두경부 편평 세포 암종의 신경 주위 침습 모델. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오에서는 마우스 등뿌리 신경절과 신경성 암세포를 공동 배양하여 체외 신경주위 암 세포 침입 모델을 개발하는 절차를 보여줍니다. 이 모델은 암 분석을 수행하여 빠르고 재현 가능한 결과를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

>1. 반고체 매트릭스 액적 준비 (플레이트 당 1 분 <)

1. 작동 현미경 아래의 얼음 블록에 미리 냉각된 유리 웰 바닥판을 놓습니다. 매트릭스의 부분 표본이 항상 얼음 위에 남아 있는지 확인하십시오.
2. 2 μL 또는 10 μL 마이크로피펫터를 사용하여 유리 바닥 플레이트의 네 모서리 각각에 1.5 μL 매트릭스 방울을 배치하고, 유리 웰의 가장자리에서 방울 자체만큼의 거리를 둡니다.
   1. 피펫 끝을 45도 각도로 유리에 직접 놓습니다. 매트릭스를 천천히 피펫팅합니다. 매트릭스가 플레이트에 맞물린 후 유리 바닥에서 천천히 멀어집니다.
      메모: 매트릭스와 유리 사이의 표면 장력은 매번 완벽한 반구를 생성해야 합니다.
   2. 팁이 비워지기 직전에 피펫팅을 중단하십시오. 왜냐하면 매트릭스 액적에 부주의하게 공기를 주입하면 매트릭스 액적의 직경이 훨씬 커지고 제거하기가 어렵기 때문입니다.
      메모: 피펫팅 손을 안정화하기 위해 두 번째 손을 사용하면 보다 정확한 배치가 가능합니다.

2. 반고체 매트릭스 액적에 DRG 삽입 (플레이트당 2분 <)

1. 매트릭스 방울이 있는 플레이트를 실온(~1분)에서 잠시 그대로 두십시오. 이렇게 하면 매트릭스가 약간 강화되어 DRG를 더 쉽게 정확하게 배치할 수 있습니다.
2. 왼손에 닫힌 현미경 집게로 DRG를 부드럽게 떠냅니다(잡지 마십시오). 다시 말하지만, 작은 흰색 DRG에 대한 어두운 배경은 시각화를 용이하게 합니다. DRG를 오른손의 21G 바늘 끝으로 옮깁니다. 이 전달은 겸자에 잔여 매체를 남깁니다.
3. 21G 바늘을 사용하여 DRG를 매트릭스 방울의 중간에 부드럽게 삽입합니다(그림 1). 대부분의 경우 DRG는 매트릭스로 쉽게 분리된 다음 바늘로 중앙에 배치할 수 있습니다.
   1. DRG가 바늘에 달라붙으면 현미경 집게를 사용하여 DRG를 바늘에서 매트릭스 방울로 밀어 넣습니다. 실험실 물티슈로 현미경 겸자에서 과도한 매체를 제거합니다.
      메모: 매트릭스에 배지를 도입하면 분석의 직경, 부피 및 일관성이 변경됩니다. 색깔 또는 색깔 있는 글씨가 있는 얼음 블록은 배경 대비를 제공하여 이 섬세한 과정을 쉽게 시각화할 수 있습니다.
4. 플레이트에 4개의 DRG가 모두 있는 후 최종 검사를 수행하여 DRG가 매트릭스 액적의 중심에 있는지 확인합니다. 21G 바늘로 필요에 따라 조정합니다.
5. 완성된 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮깁니다. 이렇게 하면 반고체 매트릭스가 단단해지고 DRG가 제자리에 고정됩니다.
6. 모든 DRG에 대해 이 프로세스를 반복합니다.DRG가 없는 빈 매트릭스 방울을 음수 대조군으로 배치합니다.
7. 모든 플레이트를 완성하고 37°C 인큐베이터에 최소 3분 동안 노출시킨 후 각 유리 바닥 플레이트에 10% FBS 배지가 포함된 DMEM 4mL를 추가합니다. 플레이트를 약간 비스듬히 놓고 매체를 천천히 추가하여 매트릭스-DRG 장치와 점차적으로 접촉하도록 합니다.
   메모: 매체가 너무 빠르거나 격렬하게 추가되면 매트릭스 및/또는 DRG가 빠질 수 있습니다.
8. 다음 48–72 h.
   동안 37 °C incubator에 분석을 보관하십시오. 메모: 분석을 주기적으로 검사하면 매트릭스 가장자리를 향한 신경돌기의 원주 성장이 나타납니다(그림 2). 신경돌기가 기질까지의 3/4 이상일 때, 세포를 플레이트화하는 것이 적절합니다.

3. 두경부암 세포의 준비

참고: 두경부 편평 세포 암종 세포 이외의 세포주를 이 실험 설계에 사용할 수 있습니다.

1. 37°C 인큐베이터에서 선호하는 플라스크 또는 배양 접시에 10% FBS로 DMEM에서 편평 세포 암종 세포주를 유지합니다. 실험을 위해 세포를 준비하려면 배양 플라스크 또는 접시에서 모든 배지를 흡입하고 PBS로 두 번 세척합니다. 적당량의 0.025% 트립신을 5분 동안 첨가하여 세포를 현탁시킨 다음 10% FBS가 포함된 DMEM을 첨가합니다. 세포 및 배지 혼합물 4mL를 6mL 배양 접시에 피펫팅합니다.
   메모: 6mL 배양 플레이트는 50% 미만의 포화도 상태에서도 충분한 세포를 제공합니다.
2. DRG 분석에서 염색 및 도금하기 24시간 전에 HNSCC 세포주를 다양한 조건에 노출시킵니다. 일관된 환경을 유지하기 위해 세포가 도금된 후 상태를 다시 투여합니다.
   메모: 항체, 성장 인자, 사이토카인 또는 기타 분자를 마우스 해부 및 DRG를 매트릭스에 이식한 후 1-2일 후에 세포 배양 접시에 추가합니다.
3. 세포를 도금하기 1시간 전(DRG 수확 및 매트릭스에 이식 후 2-3일 후)에 형광 세포 염색을 추가합니다.
   메모: 여기에 사용된 특정 염색은 세포막을 자유롭게 통과합니다. 그러나 세포 내 티올 그룹과 반응한 후 염색은 세포 내에 남아 딸 세포로 전달됩니다. 염색은 분석 내에서 시각화를 크게 촉진합니다. 이러한 임시 염색은 이러한 실험의 기간인 2-3일 동안 형광이 존재하기 때문에 이러한 분석에 이상적입니다. 또한 다양한 색상을 사용할 수 있으며 형광 단백질 형질 주입 세포주를 생성할 필요가 없습니다.
   1. 모든 세포 상태에 대해 2mL의 무혈청 DMEM에 2μL의 10mM 스톡 세포 염색을 혼합하여 10μM의 염료 용액을 준비합니다. 세포에 첨가하기 전에 이것을 37 °C로 데우십시오.
   2. 6mL 플레이트 내의 배양 배지를 제거하고 플레이트에 부착된 HNSCC 세포는 그대로 둡니다. 인산염 완충 식염수(PBS) 2mL를 추가하고 각 플레이트에 추가된 10μM 세포 염색/무혈청 DMEM 2mL를 제거합니다.
   3. 세포 염색이 있는 6mL 배양 플레이트를 37°C 배양기에 40분 동안 다시 넣습니다.
   4. 40분 후 배지를 흡입합니다. PBS 2mL를 첨가한 다음 흡인합니다. 각 플레이트에 0.025% 트립신 1mL를 추가하고 37°C incubator에서 교체합니다.
   5. 3-5분 후 10% FBS가 포함된 DMEM 2mL를 첨가하고 부유 세포를 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 세포를 스핀하고 10% FBS가 포함된 1mL의 DMEM에 재현탁합니다.
   6. 혈구계 또는 자동 세포 계수기로 세포를 계수한 다음 10% FBS가 포함된 DMEM을 추가하여 mL당 300,000개의 세포 농도를 생성합니다.

4. 두경부암 세포 도금

1. incubator.
   에서 matrix-DRG assay를 사용하여 유리 바닥 플레이트를 제거합니다. 메모: 다시 말하지만, 신경돌기가 기질의 가장자리까지 75% 이상 떨어져 있을 때 적합하며, 일반적으로 2-3일 후에 발생합니다. 이것은 최소 10X 대물렌즈를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
2. 유리 바닥판 내의 매체를 흡입합니다. matrix-DRG 장치를 제거하지 않고 유리 웰 내의 매체를 완전히 흡인합니다.
3. 200 μL 피펫을 사용하여 300,000 cells/mL 배지 중 200 μL를 추출합니다. 각 matrix-DRG assay에 세포 두 방울을 떨어뜨립니다. 각 매트릭스 방울에 대해 이 단계를 수행하여 하나의 플레이트에서 각 셀 조건을 4번 반복합니다.
   메모: 매트릭스의 반구형 모양으로 인해 세포가 분석 주변을 따라 고리 모양으로 정착할 수 있습니다(그림 3a, 그림 3b). 부드러운 방아쇠가 있는 피펫을 찾으면 균일한 방울을 훨씬 쉽게 배치할 수 있습니다.
4. 4X 현미경 검사에서 유사한 세포 수와 다양한 세포 상태의 분포를 확인합니다.
5. 유리 바닥판을 37°C 인큐베이터에 약 60분 동안 놓습니다.
   메모: 비록 적은 양의 세포와 배지(~150 μL)만 존재하지만, 인큐베이터 시간이 몇 시간 경과할 때까지 분석이 마르지 않습니다.
6. 60분 후 유리 바닥판의 측벽을 따라 10% FBS가 포함된 DMEM 4mL를 부드럽게 추가합니다.
   메모: 일정 기간 동안 세포는 플레이트 바닥에 부분적으로 부착되며 배지를 추가하는 방법은 세포를 방해하지 않습니다. 다른 세포 유형은 유리 바닥 플레이트에 부착되기 시작하는 데 더 많거나 적은 시간이 걸릴 수 있습니다.
7. 이 시기에 외인성 약물 또는 성장 인자를 교체하여 이전 농도 수준을 유지하십시오.
8. 현미경으로 검사하는 경우를 제외하고 분석을 37°C incubator로 다시 반환합니다. 이 분석의 결과를 현미경 이미징으로 정량화합니다. 간단히 말해서, 4X 현미경 이미지를 사용하여 4개의 사분면 내에서 신경 주위 침입의 가닥을 계산합니다.
   메모: 4X 대물렌즈와 형광 기능을 갖춘 현미경은 분석을 사진 문서화하는 데 적합합니다. 분석의 크기는 신경 주위 침습의 개별 영역을 포착할 수 있을 만큼 충분히 상세한, 4X 대물렌즈 분야에 잘 맞습니다. 신경주위 침입은 24시간 이내에 명백해지지만 48시간이 지나면 종양 세포가 기질의 주변을 따라 분열하고 침입함에 따라 분석의 무결성이 약해지기 시작합니다. 48시간을 초과하면 DRG에서 섬유아세포가 상당히 유출되어 명시야 현미경을 사용한 시각화를 모호하게 합니다. 따라서 이 기간 동안 최소 두 번(예: 종양 세포 도금 후 24시간 및 48시간) 4X 현미경으로 결과를 사진 문서화하는 것이 좋습니다. 이는 3차원 분석이며 전체 분석을 완전히 이미지화하기는 어렵다는 점에 유의하십시오. 대부분의 신경주위 침습은 판의 바닥에서 평면에서 발생하며, 여기서 세포는 판의 바닥보다 약간 높은 기질에 내장되어 있습니다. 이 평면은 수평에 가깝기 때문에 종양 세포가 있는 대부분의 신경돌기는 4X에서 단일 수준 이미지로 캡처됩니다.

결과

그림 1. DRG-매트릭스 분석. 매트릭스 액적 내에서 등쪽 뿌리 신경절의 올바른 위치, 4X에서 명시야 현미경으로 표시. 축척 막대는 1mm를 나타냅니다.

그림 2. 신경돌기의 성장. 신경돌림은 DRG를 기질 방울(A)에 넣은 직후 0일에 없습니다. 1일차(B)까지 신경돌기 분양은 명시야 현미경 검...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F-12 50/50 L-글루타민 및 15 mM HEPES와 혼합	코닝 Cellgro	10-090-이력서	버지니아주 머내서스
소 태아 세럼	애틀랜타 생물학 제제	S11150	플라워리 브랜치, 조지아
0.25% 트립신-EDTA (1x)	생명 기술 공사	25200056	그랜드 아일랜드, 뉴욕
인산염 완충 식염수 1x	코 닝	21-040-CM	버지니아주 머내서스
Matrigel hESC-Qualif 마우스	코닝 주식회사	354277	베드퍼드, 매사추세츠
감마선 조사 35mm 유리 바닥 배양 접시	MatTek 코퍼레이션	P35G-1.5-14-C	매사추세츠주 애슐랜드
SteREO Discovery.V8 작동 현미경	Carl Zeiss 마이크로이미징	제495015-0021-000	쏜우드, 뉴욕
Schott ACE I 광원	쇼트	A20500	독일
셀트래커	생명 기술 공사	C2925	칼즈배드, 캘리포니아
BD 프리시전글라이드 바늘 21 g	BD (영어)	305195	프랭클린 레이크, 뉴저지

호