Cancer Side Population Discrimination Assay: Hoechst Dye Efflux Assay를 사용하여 암 줄기 유사 세포를 분리하는 방법

초록

출처: Gilormini, M. et al. 줄기세포 특성을 가진 두경부 편평 세포 암종 하위 집단의 격리 및 특성화. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오에서는 형광 활성화 세포 분류기(FAC)를 사용하여 두경부 편평 암종 세포주에서 암 줄기 유사 세포의 하위 집단을 분리하는 방법을 설명합니다. 세포의 분리된 측면 집단은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. Hoechst Dye Efflux Assay에 의한 SP(Side Population) 선택

1. Hoechst 33342 염료로 5,000만 개의 세포 염색
   1. 바닥이 원뿔형인 15mL 멸균 튜브 2개를 준비합니다: 한 튜브는 "Hoechst"라고 표시되고 다른 튜브는 "Hoechst and Verapamil"이라고 표시되어 있습니다. 멸균수에 5mM 베라파밀 염산염 용액 10mL를 준비합니다. 줄기세포를 위한 배양액(CM)을 준비합니다.
      1. CSC(CM-CSC)에 대한 CM을 준비하려면 다음을 결합하십시오: Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM):F12(1:3, v:v), 태아 송아 혈청(FCS) 5%, 하이드로코르티손 0.04mg/L, 페니실린 100U/mL, 스트렙토마이신 0.1g/L 및 표피 성장 인자(EGFR) 20μg/L.
   2. 층류 후드 아래에서 세포를 트립신화합니다. 배지를 제거하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 다음 75cm² 플라스크에 1mL의 트립신-EDTA(0.5g/L)를 추가합니다. 37°C에서 3분 동안 배양합니다.모 세포주에 사용되는 배양 배지를 추가하여 반응을 중지합니다. 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다.
      1. 모 세포주(CM-P)에 대한 CM을 준비하려면 DMEM에 10% FCS, 0.4mg/L의 하이드로코르티손, 100U/mL의 페니실린 및 0.1g/L의 스트렙토마이신)을 보충합니다.
   3. 1.1.2단계에서 얻은 세포 현탁액을 희석하여 CM-P에서 10⁷ cells/mL를 얻습니다. 준비된 두 개의 튜브에서 세포 현탁액을 분할합니다 : 튜브 "Hoechst 및 Verapamil"에 100 μL (10⁶ 셀)를 넣고 튜브 "Hoechst"에 4 mL (4 x 10⁷ 셀)를 넣습니다.
   4. "Hoechst and Verapamil" 샘플에 10μL의 5mM 베라파밀 염산염 용액(최종 농도: 0.5mM)을 넣고 부드럽게 혼합합니다. 5μL의 1g/L Hoechst 용액을 추가합니다(최종 농도: 0.1g/L). "Hoechst" 샘플에서 10⁶ 셀당 5 μL의 1 g/L Hoechst 용액(총 200 μl)을 추가합니다. 이제부터 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선에 노출되지 않도록 샘플을 보호하십시오.
   5. 모든 튜브를 37°C의 수조에서 1시간 30분 동안 배양하고 세포가 가라앉는 것을 방지하기 위해 15분마다 부드럽게 혼합합니다.
   6. 250 x g의 원심분리기 튜브를 4°C에서 5분 동안 가열합니다.상층액을 제거하고 각 펠릿을 1x PBS 2mL로 재현탁합니다.
   7. 250 x g의 원심분리기 튜브를 4°C에서 5분 동안 사용합니다. 상층액을 제거합니다. PBS 완충액에 희석된 5mg/L 프로피듐 요오드화물(PI) 500μL에 "Hoechst 및 Verapamil" 펠릿을 재현탁하고 PBS 완충액에 희석된 5mg/L PI 4mL에 "Hoechst" 펠릿을 재현탁합니다.
   8. 70 μm 세포 스트레이너를 통해 시료 용액을 전달하여 응집체를 제거하고 튜브에 단일 세포를 수집하여 유세포 분석기에서 시료를 흡수합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하고 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선에 노출되지 않도록 보호하십시오.

2. 세포 분류에 의한 Hoechst 염료를 제외한 측면 개체군의 격리

1. UV 레이저(355 nm), 파란색 Hoechst(450/50 BP) 및 빨간색 Hoechst(610/20 BP) 필터가 있는 UV 레이저 경로에 있는 2개의 검출기, 2개의 수집기 파라미터를 사용하여 유세포 분석 분류기에서 Hoechst 음성 세포 분리를 수행합니다.
   1. 먼저, 염색 및 유세포 분석기 설정을 위한 positive control 역할을 하는 샘플 "Hoechst"를 분석합니다.
   2. 세포 분석기 소프트웨어를 사용하여 "Global Worksheet" 창에서 "Dot Plot"(오른쪽 상단 다섯 번째 그림)을 클릭하고 글로벌 워크시트에 차트를 만듭니다. 세로좌표에서는 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 FSC-A(전방 산란)를 선택하고 가로 좌표축에서는 SSC-A(측면 산란)를 선택합니다(그림 1A). 같은 방식으로 SSC-W 대 SCC-H 점도표를 만듭니다. 이 두 번째 점도표에서 P1 영역을 만들려면 "폴리곤 게이트"(오른쪽 상단 14번째 그림)를 클릭합니다(그림 1B).
      메모: P1 영역은 단일 세포를 포함하고 이중선을 구별합니다.
   3. 선택 사항: P1에서 PI 게이트와 FSC-A를 생성하여 PI 양성 세포를 제외합니다. 이 점도표에서 PI 음성 모집단(P2)을 선택하여 PI 양성 사세포를 제외합니다.
   4. 세포 분석기 소프트웨어를 사용하여 "Global Worksheet" 창에서 "Dot Plot"을 클릭하고 글로벌 워크시트에 차트를 만듭니다. 세로좌표에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 파란색 Hoechst-A를 선택하고 가로 좌표에서 빨간색 Hoechst-A를 선택합니다. 인구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "인구 표시"와 P1을 선택합니다. 이 점도표에서 영역(P2)을 생성하여 주요 세포 집단의 왼쪽에 side arm으로 나타나는 negative Hoechst dye side population(SP) 세포를 선택합니다(그림 1C).
2. 샘플 "Hoechst"를 분석하고 10,000개의 이벤트를 수집합니다. SP 모집단을 나타내는 게이트 P2가 올바른 위치에 있는지 확인하려면 표본 "Hoechst 및 Verapamil"(10,000개 이벤트)을 분석하여 SP 개체군의 소멸을 관찰합니다(그림 1D).
3. 1.1.1단계에서 준비한 1mL의 CM-CSC가 들어있는 15mL 튜브에 SP Hoechst 염료 음성 세포를 수집합니다.
4. 세포 분류가 끝나면 250 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거한 후 1mL의 CM-CSC로 펠렛을 재현탁합니다. 세포 계수기를 사용하여 정렬된 세포의 수를 계산하고 적절한 수의 세포를 배양 플라스크로 이동합니다(표 1 참조). CM-CSC를 첨가하고 37°C 및 5% CO₂ 기압에서 배양합니다.
5. 최소 5 x 10⁷ 세포가 될 때까지 최대 2개의 계대 동안 동일한 조건에서 배양된 세포를 유지합니다.

표 1: 분류된 세포의 수에 따라 사용할 배양 플라스크 유형.분류된 세포의 대략적인 수에 대한 배양 플라스크 크기의 세부 정보가 제공됩니다. 배양 플라스크 유형에 필요한 트립신의 부피와 배지의 부피도 제공됩니다.

웰 개 개 개 개 개 분

정렬된 셀 수	배양 플라스크 유형	트립신 부피 (mL)	배양 배지 부피 (mL)
10,000-200,000	1웰 플레이트 또는 3.5cm 페트리 접시 6	0.5	2
200,000-1,000,000	T25 배양 플라스크 1	1	4
>1,000,000	1 T75 배양 플라스크	2	10

결과

그림 1: Hoechst 염료를 제외한 side population의 분리.(A) FSC-A 대 SSC-A 점도표. (B) SSC-W 대 SSC-H 점도표. (C, D) "Hoechst" 튜브(C) 또는 "Hoechst 및 베라파밀" 튜브(D)를 사용한 Hoechst Red-A 대 Hoechst Blue-A 도트 플롯.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
태아 송아지 세럼 골드	GE 헬스케어	대답15-151
하이드로 코르티손 수용성	시그마-알드리치	H0396-100MG
페니실린/스트렙토마이신 100x	도미니크 뒤처	L0022-100
DMEM을 참조하십시오.	지브코	61965-026
F12 너트 믹스 (1x) + GlutaMAX-I	지브코	제31765-027
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B-27 보충 (50x), 마이너스 비타민 A	지브코	제12587-010
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회스트: 33342	시그마-알드리치	14533	부식성, 급성 독성 (경구, 피부, 흡입) 구분 4
베라파밀 염산염	시그마-알드리치	V-4629	급성 독성 (경구, 피부, 흡입) 카테고리 3
프로피듐 요오드화물	시그마-알드리치	P4170	급성 독성 (경구, 피부, 흡입) 카테고리 4
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