메틸 티아졸릴 테트라졸륨 또는 MTT 분석법: 암세포의 대사 활성을 측정하여 약물 내성을 측정하기 위한 비색 분석

초록

출처: Sciarrillo, R. et al. RNA 염기서열 분석을 사용하여 체외 암 모델에서 약물 내성과 관련된 새로운 스플라이스 변이체를 검출합니다. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 암세포에서 약물 유도 세포 독성을 측정하고 암세포의 대사 활성을 결정하기 위한 비색 분석, 메틸 티아졸 테트라졸륨(MTT) 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 테트라졸륨 염이 세포의 미토콘드리아 활성을 반영하는 착색 제품으로의 대사 변환을 기반으로 합니다.

프로토콜

1. 백혈병 세포에 대한 MTT 분석

1. MTT 용액을 미리 준비하십시오 : 10mL PBS에 500mg의 MTT 포르 마잔을 녹이고 약 1 시간 동안 자석 교반기로 약 1 시간 동안 교반 (빛으로부터 보호)합니다. 0.22 μm 필터로 용액을 살균합니다 .
   메모: 용액은 -20°C에서 10mL 분취액에 보관할 수 있습니다.해동 후 직사광선을 피하십시오.
2. 산성화된 이소프로판올 미리 준비: 2.5L의 이소프로판올에 2M HCl 50mL를 추가합니다.
   메모: 사용하기 전에 용액을 실온에서 최소 한 달 동안 보관하십시오. 이소프로판올이 올바르게 산성화되지 않으면 매질과 함께 침전물을 형성하고 분광광도계 판독을 손상시킬 수 있습니다.
3. 성장 억제를 보다 정확하게 추정하기 위해 별도의 96-well flat bottom "Day 0"(control) 플레이트를 준비합니다: 세포주당 3-6개의 well을 전용으로 할당하고, 각 well당 30μL의 성장 배지와 120μL의 세포 현탁액(8,000개 세포)을 추가하고, 150μL의 성장 배지를 blank(세포 없음)에 해당하는 well에 추가합니다. 이 섹션의 1.9단계부터 1.13단계까지 진행하여 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
4. 96웰 평평한 바닥 실험 플레이트 준비: 30웰은 약물 농도(10개 농도, 각각 3회), 10웰은 세포를 제어하고, 10웰은 세포가 없는 매체(블랭크)를 제어하고, 디메틸 설폭사이드를 용매로 사용하여 덱사메타손(Dex)의 약물 희석 범위를 준비합니다.
   메모: CEM-WT 세포의 경우 Dex 희석 범위는 2μM에서 0.97nM 사이입니다. CEM/R30dm, CEM-R5 및 CEM-C3 세포의 경우 Dex 희석 범위는 640μM에서 0.33nM 사이입니다.
5. 각 Dex 희석액에서 30μL를 96웰 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 각 농도를 삼중으로 포함해야 합니다.
6. 대조 세포에 해당하는 웰에 30μL의 성장 배지를 추가하고 블랭크에 해당하는 웰에 150μL의 성장 배지를 추가합니다.
7. 기하급수적으로 성장하는 세포를 수확하고 최적의 파종 농도에서 재현탁합니다.
   메모: 최적의 시작 세포 농도를 결정하기 위해서는 여러 농도로 세포를 파종하고 최소 4일 동안 매일 측정하여 96웰 플레이트에서 각 세포주의 성장 프로파일을 평가하는 것이 좋습니다. 72시간 후에 세포의 과잉 증식을 방지하는 파종 농도를 선택하면 OD 값을 포화시켜 실험에 영향을 미칩니다. CEM-WT, CEM-C5 및 CEM-R5의 경우 최적의 파종 농도는 8,000 cells/well인 반면 CEM/R30dm의 경우 5,000 cells/well입니다.
8. 약물 용액 또는 성장 배지(대조 세포에 해당하는 웰)를 포함하는 각 웰에 120μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 플레이트의 빈 외부 웰을 150μL PBS로 채워 플레이트의 우수한 습도를 보장하고 세포 배양 인큐베이터에서 5% CO₂로 37°C에서 72시간 동안 플레이트를 배양합니다.
9. 각 웰에 15μL의 MTT 용액을 추가하고 플레이트 셰이커로 최대 900회/분까지 플레이트를 5분 동안 흔듭니다.
10. 세포 배양 인큐베이터에서 5% CO₂로 플레이트를 37°C로 다시 놓고 4-6시간 더 배양합니다.
11. 각 웰에 150μL의 산성화된 이소프로판올을 추가하고 멀티채널 피펫과 잘 혼합하여 모든 포르마잔 결정을 완전히 재현탁시킵니다. 빈 우물부터 시작하여 플레이트의 다른 행으로 진행하기 전에 팁을 잘 헹굽니다.
12. 플레이트를 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
13. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540 및 720 nm에서 OD를 측정하여 백그라운드 OD를 보정하여 정확한 측정을 보장합니다. 그런 다음 스프레드시트 파일에 데이터를 저장하고 분석합니다.

2. MTT 분석을 위한 데이터 분석

1. 다음 공식을 사용하여 "Day 0"에서 셀의 OD 값을 계산합니다.
   OD_{Day 0} = OD_{제어 셀} - 평균 OD_{블랭크 웰}
2. 다음 공식에 따라 각 약물 농도에 대해 생존 세포의 백분율을 계산합니다.
   % 처리된 세포 = 평균 [OD_{처리된 세포} - 평균 OD_{블랭크 웰} - OD_{Day 0}]/[OD_{제어 셀} - 평균 OD_{블랭크 웰} - OD_Day0]*100
3. 용량-반응 곡선(약물 농도 대 성장 억제(%))을 표시합니다.
4. 용량-반응 곡선을 사용하여 세포의 성장을 50%(IC50) 억제하는 약물의 농도를 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CCRF-CEM	ATCC, 미국 버지니아주 머내서스	ATCC CCL-119
RPMI-1640	Gibco, 미국 캘리포니아주 칼즈배드	11875093
소 태아 & 송아지 세럼	Greiner Bio-One, 프리켄하우젠, 독일	758093
페니실린 G 스트렙토마이신 황산염	Gibco, 미국 캘리포니아주 칼즈배드	15140122
트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄	시그마 알드리치	252859
CELLSTAR 세포 배양 플라스크 25cm 정사각형	Greiner Bio-One, 프리켄하우젠, 독일	82051-074
MTT 포마잔	시그마 알드리치	엠2003
안토스 - 엘리사 - 리더 2001	Labtec, Heerhugowaard, 네덜란드		UV-Vis 96웰 플레이트 분광 광도계
Greiner CELLSTAR 96웰 플레이트	테스 그라이너/시그마	M0812-100개
인산염 완충 식염수(NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, 독일	362호 3140
트립신/EDTA 용액 100ml	Lonza, Basel, 스위스	CC-5012

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