DAPI 염색을 사용한 세포 사멸 스크리닝: 암 세포주에서 IR 유도 클론 생성 세포 사멸의 신속한 스크리닝 방법

초록

출처: Kobayashi, D. et al. 형광 현미경에 의한 방사선 유도 클론생성 세포 사멸 모드 평가를 위한 원스텝 프로토콜. J. Vis. 특급. (2017년)

이 동영상은 DAPI 염색 분석을 사용하여 전리 방사선(IR) 유도 암 세포주에서 주요 세포 사멸 프로파일을 스크리닝하는 방법을 보여줍니다. 세포 사멸을 겪고 있는 표적 세포의 DAPI 염색 핵은 뚜렷한 형태를 나타내며 형광 현미경으로 쉽게 식별할 수 있습니다.

프로토콜

1. 재료 준비

1. 오토클레이브 커버슬립
   1. 유리 비커에 커버 슬립을 놓습니다.
   2. 유리 비커를 호일로 덮습니다.
   3. 121°C에서 15psi에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
   4. 50 °C에서 건조합니다. 배양 후드에 실온에 보관하십시오.
2. 정착 용액 준비: 3% 파라포름알데히드 + 2% 인산염 완충 식염수(PBS) 중 자당
   1. 1,000mL 유리병에 PBS 700mL와 파라포름알데히드 30g을 추가합니다.
      주의: 파라포름알데히드는 부식성이므로 적절한 장갑을 착용하십시오.
   2. 전자레인지를 사용하여 80°C로 가열하여 파라포름알데히드를 완전히 용해합니다.
      주의: 파라포름알데히드 연기는 독성이 있으므로 마스크를 착용하십시오.
   3. 실온에서 하룻밤 동안 그대로 두십시오.
   4. 자당 20g을 넣으십시오.
   5. PBS를 추가하여 총 부피를 1L로 만듭니다.
   6. 50 mL 튜브의 부분 표본. 정착액은 -20°C에서 3년 또는 4°C에서 3개월 동안 보관할 수 있습니다.

2. 조사

주의: 제조업체의 지침에 따라 X선 조사기를 조심스럽게 다루십시오.

1. 역상 현미경으로 세포를 검사합니다. 세포가 커버슬립에 부착되어 있고 살아 있는지 확인합니다.
2. 접시에 6Gy X선(1.4Gy/min, 300 KVP, 20mA)을 조사합니다.
3. 5 % CO₂.
   를 포함하는 대기에서 37 ° C에서 72 시간 동안 배양하십시오. 메모: 배양 시간은 실험 설계에 따라 수정할 수 있습니다.

3. 고정

1. 접시에서 배양 배지를 흡인합니다.
2. 가위를 사용하여 1,000μL 마이크로피펫 팁의 끝을 끝에서 5mm 자릅니다.
   메모: 절단 팁은 고정 솔루션을 원활하게 적용하는 데 도움이 됩니다.
3. 절단 팁을 사용하여 접시 측벽에서 접시에 1mL 고정 용액(1.2단계에서 준비)을 추가합니다.
   메모: 이 단계는 시간에 민감하므로 여러 샘플을 처리할 때 마이크로피펫 팁을 변경하지 않고 수행해야 합니다. 접시 바닥에 고정 용액을 직접 바르면 세포가 손상될 수 있습니다.
4. 정사각형 배양 접시에 접시를 놓습니다. 정사각형 배양 접시를 부드럽게 흔들어 고정 용액을 커버슬립 위에 고르게 분포시킵니다.
5. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
6. 접시에서 Aspirate Fixation Solution.
7. 접시 측벽에서 접시에 PBS 2mL를 추가합니다.
   메모: PBS를 접시 바닥에 직접 바르면 세포가 손상될 수 있습니다.
8. 접시에서 PBS를 흡입합니다.
9. 3.7단계와 3.8단계를 두 번 반복합니다.
   메모: 이 접시는 4 ° C에서 1 주일 동안 보관할 수 있으며 커버 슬립을 2mL PBS에 담근 상태로 보관할 수 있습니다.

4. DAPI 염색

1. 유리 슬라이드에 5 μL 1 μg/mL DAPI 염색 시약을 도포합니다.
   메모: DAPI 염색 시약은 -20°C 이하에서 빛으로부터 보호되어 보관할 경우 6개월 동안 안정적입니다.
2. 메스를 사용하여 접시에서 커버슬립을 제거합니다.
3. 종이 타월로 커버슬립의 가장자리를 만져 커버슬립의 여분의 PBS를 빼냅니다.
4. 세포가 DAPI 염색 시약에 노출되도록 유리 슬라이드의 DAPI 염색 시약 방울에 커버슬립을 거꾸로 장착합니다.
   메모: 이 단계는 시간에 민감합니다. DAPI 염색 시약의 건조는 최적이 아닌 염색으로 이어질 수 있습니다.
5. 샘플은 -20 °C에서 1 년 동안 보관할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
커버 슬립	마츠나미	C013001
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148-1KG
자당	시그마-알드리치	84097-250지
인산염 완충 식염수	코스모 바이오	16232000
메스	카이 메디컬	20 번, 520-A
35mm 세포 배양 접시	송골매	353001
도립 위상 현미경	시마즈	114-909
X선 조사기	Faxitron 바이옵틱	팩시트론 RX-650
광장 문화 요리	코 닝	431110
슬라이드 유리	마츠나미	프로-11
DAPI 염색 시약	세포 신호 전달	8961 분
형광 현미경	니콘	이클립스 Ni
형광 현미경 DAPI 필터	니콘	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
형광 현미경 렌즈 (20×)	니콘	플랜 아포 λ 20X/0.75
형광 현미경 렌즈(60×, 오일)	니콘	플랜 아포 λ 60X/1.40 오일
기름	올림푸스	N5218600
CCD 카메라	니콘	DS-Q2
디지털 이미지 수집 소프트웨어	니콘	NIS-Elements 문서
렌즈 클리너	올림푸스	오타0552
클로로포름	와코	TEL.035-02616

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