Decellularized Porcine Esophageal Scaffold Preparation: A Technique: A Techniques to Generate Acellular Scaffold from a Pig Esophagus (탈세포화된 돼지 식도 골격 준비: 돼지 식도에서 무세포 골격을 생성하는 기술)

초록

출처: Green, N. H. et al. 3D 조직 공학 인간 식도 점막 모델의 생산, 특성화 및 잠재적 사용. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오에서는 조직 공학 응용 분야를 위해 생화학적 구조와 구성이 보존된 탈세포화된 돼지 식도 골격을 준비하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 탈세포화된 식도 골격의 준비

1. 도살장에서 갓 도축한 재래종 돼지를 식용으로 사용하는 온전한 돼지 식도를 얻습니다. 하나의 단일 식도는 약 30개의 개별 구조물에 충분한 골격을 제공합니다.
   메모: 광범위하고 시간이 많이 소요되는 멸균 프로토콜로 인해 일반적으로 한 번에 최소 10개의 식도를 확보하고 처리하는 것이 좋습니다.
2. 갓 절제된 식도를 약 150mL의 10% 포비돈-요오드 용액이 들어 있는 180mL 멸균 냄비에 즉시 5분 동안 넣어 오염되는 미생물 부하를 줄입니다. 200 IU/mL 페니실린, 200 μg/mL 스트렙토마이신 및 1.25 μg/mL 암포테리신 B를 함유한 약 100 mL의 멸균 PBS가 들어 있는 두 번째 포트로 식도를 옮깁니다.
   1. 용기의 뚜껑을 다시 닫고 식도를 실온의 실험실로 다시 운반합니다. 식도는 크기에 따라 각 용기에 2개 또는 3개 넣을 수 있습니다.
3. 실험실에 도착하면 미생물 오염을 최소화하기 위해 무균 기술을 사용하여 층류 후드의 조직을 처리합니다. 핀셋, 가위, 메스 칼날을 70% 에탄올에 5분 동안 담갔다가 멸균된 PBS로 헹궈 살균합니다.
4. 멸균 핀셋을 사용하여 식도를 다루십시오. 가위를 사용하여 식도를 세로로 자릅니다. 약 100mL의 멸균 PBS가 들어 있는 180mL 멸균 냄비에 식도를 넣고 부드럽게 흔들어 이물질을 제거하여 조직을 헹굽니다.
5. 코르크 해부 보드에 70% 에탄올을 넉넉히 분사하여 청소하고 건조시킵니다.
6. PBS에서 식도를 제거하고 멸균 바늘을 사용하여 점막 표면이 가장 위에 있는 보드에 식도를 고정합니다. 멸균 핀셋으로 식도의 한쪽 끝에 있는 점막 표면을 잡고 보드에서 당겨 빼냅니다. 이렇게 하면 점막이 기저의 점막하와 분리됩니다.
   1. 그런 다음 멸균 메스 날을 사용하여 얇은 판을 따라 식도를 세로로 절개하고 박리가 진행됨에 따라 핀을 제거하여 점막을 들어 올릴 수 있습니다.
7. 절개된 점막은 유지하고 밑에 있는 점막하는 버립니다.
8. 점막의 가장 근위부와 원위부 2cm는 각각 점막하선의 수가 더 많고 두꺼운 얇은 판
이 더 두꺼워지므로 잘라내어 버립니다.
9. 메스를 사용하여 나머지 조직을 5cm²로 자릅니다. 약 150mL의 멸균 PBS가 들어 있는 180mL 멸균 냄비에 절단된 모든 조직을 넣고 부드럽게 저어 조직을 헹굽니다. 한 번에 5개 이상의 식도를 처리하는 경우 이 단계와 후속 3단계를 위해 여러 개의 냄비를 사용해야 할 수 있습니다.
10. 멸균 핀셋을 사용하여 절단된 조직을 150mL의 멸균 1M NaCl, 200IU/mL 페니실린, 200μg/mL 스트렙토마이신 및 1.25μg/mL 암포테리신 B가 들어 있는 180mL 포트로 옮깁니다.37°C에서 72시간 동안 배양합니다.
11. 150mL 멸균 PBS가 들어 있는 새 180mL 냄비에 조직을 넣습니다. 상피는 기저 조직으로부터 눈에 띄게 분리되기 시작했을 것입니다. 멸균 집게를 사용하여 돼지 식도에서 분리되는 상피를 부드럽게 벗겨내고 버립니다.
    1. 남은 조직을 180mL의 새 냄비에 넣고 150mL의 멸균 PBS를 추가합니다. 5분 동안 부드럽게 저어 씻습니다. PBS를 붓고 새 PBS로 두 번 더 반복합니다.
12. 모든 조직을 500mL의 멸균 80%(v/v) 글리세롤 용액이 들어 있는 80mL 유리병에 실온에서 24시간 동안 넣습니다. 멸균 90%(v/v) 글리세롤 용액 400mL로 옮기고 24시간 더 기다립니다.
13. 400mL의 멸균 100% 글리세롤 용액에 넣어 실온에서 최소 4개월 동안 보관하여 기저막의 무결성을 보존하면서 조직을 탈수 및 멸균합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM을 참조하십시오.	랩텍	LM-D1112	사용 전 37°C의 수조에서 따뜻하게 하십시오
햄스 F12	랩텍	LM-H1236	사용 전 37°C의 수조에서 따뜻하게 하십시오
태아 송아지 세럼	랩텍	FB-1090
표피 성장 인자	R+D 시스템	236-EG-200	10mM 아세트산, 1% FCS에 200μg/ml 원액을 준비합니다.
콜레라 독소	시그마-알드리치	C8052	물에 원액을 준비하십시오.
L-글루타민	시그마-알드리치	G7513
페니실린-스트렙토마이신	시그마-알드리치	P0781
암포테리신 B	지브코	제15290-026	브랜드 이름 : Fungizone
PBS (PBS)	옥소이드	BR0014	100ml의 물에 녹이고 오토클레이브를 사용하여 살균합니다.
콜라겐분해효소 A	로슈	10103578001
포비돈-요오드 용액	이콜랩	10830E	브랜드 이름 : Videne
에탄올	시그마-알드리치	E7023
첼렉스 100	시그마-알드리치	C7901
신생아 송아지 세럼	지브코	26010074
15ml 범용 튜브	증권 시세	SLS7504
냄비 180ml	폭스바겐	Tel.: 216-2603

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