마그네틱 비드 기반 엑소좀 추출: 생체 유체에서 특정 엑소좀을 분리하는 기술

초록

출처: Tu, M. et al. 전기장 유도 방출 및 측정(EFIRM)에 의한 엑소솜 바이오마커 검출. J. Vis. 특급 (2015년)

이 동영상에서는 마그네틱 마이크로비즈를 사용하여 타겟 바이오유체에서 엑소좀을 분리하는 절차를 보여줍니다. 이 절차를 통해 엑소좀을 빠르게 포획할 수 있으며, 엑소좀은 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 마그네틱 비드 기반 엑소좀 추출

1. 5μL의 Streptavidin으로 코팅된 자성 미세입자의 잘 혼합된 용액을 마이크로 원심분리기 튜브의 495μL의 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액에 피펫팅하여 비드를 재현탁합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 500μL의 PBS로 비드를 세척하고 다시 부유시킵니다. 랙은 샘플 마이크로 원심분리기 튜브를 수용할 수 있는 하우징 장치 측면에 있는 자석 배열입니다.
   1. 세척할 때마다 먼저 튜브를 랙에 1분 동안 놓아둔 다음 피펫 팁을 사용하여 비드를 방해하지 않고 상층액 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.
   2. 측면에 자석이 없는 일반 랙에 튜브를 놓습니다. 튜브에 PBS 500μL를 추가하고 피펫을 사용하여 용액과 비드를 함께 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 다시 올려 놓고 용액에서 비드를 다시 분리합니다.
   3. PBS에서 자화 및 재현탁을 통해 버퍼를 총 3회 제거합니다. 이것은 자성 입자의 초기 세척을 수행합니다.
2. 비드를 490μL의 PBS 버퍼에 다시 부유시키고 튜브를 마그네틱 랙의 자화되지 않은 부분에 놓습니다. 비드 혼합물에 1.0 mg/mL 스톡 농도의 5 μL의 비오틴화된 마우스 항-인간 CD63 항체를 피펫팅합니다. 피펫을 사용하여 비드와 항체를 용액에 혼합합니다.
3. 비드와 비오틴화 항체 혼합물이 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 샘플 로테이터에 놓습니다. 샘플 로테이터에 대한 로테이터 매개변수를 설정하여 90°에서 역회전, 5초 동안 기울이기, 5초 동안 1° 진동을 수행합니다. 이 매개변수에서 샘플-비드 혼합물 튜브를 RT에서 30분 동안 회전합니다.
4. 접합 후 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
   1. RT에서 30분 동안 회전한 후 튜브를 마그네틱 랙에 다시 5분 동안 놓습니다.
   2. 마이크로피펫을 사용하여 액상을 제거하여 비드를 3회 세척하고 500μL의 PBS로 세척합니다. 3중 세척 후 비드를 490μL의 카제인-PBS에 다시 현탁시키고 랙의 자화되지 않은 부분에 놓습니다.
5. 항체 코팅된 비드를 사용한 엑소좀 추출.
   1. 각 튜브에 대상 검체 ID를 표시합니다. 10μL 샘플의 혈청 또는 타액을 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 넣습니다. 피펫을 사용하여 여러 번 피펫팅하여 샘플과 마그네틱 비드를 혼합합니다.
   2. 샘플과 항인간 CD63 항체 비드가 있는 튜브를 회전기에 놓고 RT에서 2시간 동안 회전합니다. 1.3단계에서 설명한 것과 동일한 회전기 매개변수를 사용합니다.
   3. 2시간 동안 샘플을 회전시킨 후 자화하여 용액에서 비드를 분리하고, 마이크로피펫으로 액상을 제거하고, 500μL의 Tris-HCl 완충액에 비드를 재현탁하여 3중 세척을 수행합니다. 그 결과로 생성된 비드는 이제 엑소좀에 결합되어 전기장 방출 및 측정을 위한 준비가 되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Biotinylated anti-human CD63 항체	Ancell, 미국	제215-030
Dynabeads MyOne 스트렙타비딘 T1	Invitrogen, 미국	65601
네오디뮴 마그네틱스(직경 1/10인치 x 두께 1/32인치)	K&J 마그네틱스, 미국	DH101
초순수 증류수	Life Technologies, 미국	10977-023
Anti-Fluorescein-POD, Fab 단편	Roche, 독일	11426346910
인산염 완충 식염수	Life Technologies, 미국	10010023
카제인/PBS	Fisher Scientific, 미국	37532