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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 조직 소화
- 100mm 조직 배양 플레이트를 사용하여 오토클레이브 멸균 해부 가위와 수술용 집게를 사용하여 조직을 ~1-2mm 크기의 미세한 조각으로 기계적으로 다집니다(그림 1B, C). 조각 사이의 결합 조직은 적절한 분리를 보장하고 추가 단계에서 쉽게 할 수 있도록 절단해야 합니다.
- 다진 조직에 dispase/collagenase 용액 6mL를 추가합니다. 그런 다음 37°C에서 약 30분에서 1시간 동안 배양합니다.
- 5mL 혈청학적 피펫으로 15-20회 피펫팅하여 조직을 파괴합니다.
- 37°C에서 30분에서 1시간 더 배양합니다.
- 1.3단계와 1.4단계를 2-3회 더 반복하거나 조직이 슬러리와 비슷해지고 파이펫 입구를 쉽게 통과할 수 있을 때까지 반복합니다(그림 1D).
메모: 조직 표본의 시작 크기와 조직 다지기의 섬세함에 따라 1.3 및 1.4 단계를 반복해야 하는 횟수가 결정됩니다. 일반적으로 약 1cm x 1cm 크기의 조직을 받습니다. 또한 표준 도립 조직 배양 현미경을 사용하여 조직 해리를 모니터링하여 조직에서 세포 해리의 진행 상황을 추적할 수 있습니다. 작은 세포 클러스터는 타액 세포가 살리스피어(salisphere)로 초기 성장하기에 이상적입니다.
2. Basement Membrane Matrix로 우물 코팅
참고: 기저막 매트릭스(BMM)는 사용하기 전날 4°C에서 밤새 해동해야 합니다. 일단 해동되면 BMM은 따뜻한 온도에서 빠르게 응고(즉, 겔 형성)되므로 얼음 또는 4°C에서 지속적으로 유지해야 합니다. 또한 차가운 샘플이 BMM을 "녹여" 세포를 플라스틱 접시에 노출시킬 수 있으므로 BMM에 도금하기 전에 샘플을 얼음 위에서 식힌 경우 주의해야 합니다.
- 코팅할 각 웰에 BMM(재료 표 참조)을 천천히 피펫팅합니다. BMM을 웰에 고르고 천천히 분배합니다.
참고: 일반적으로 6웰 플레이트의 각 웰당 500μL를 사용하지만, 이 부피는 12웰 또는 24웰과 같은 다른 플레이트 변형에 사용하기 위해 조정하거나 더 두껍거나 더 얇은 하이드로겔에 대해 원하는 대로 조정할 수 있습니다.
- BMM이 응고될 때까지 사용하기 전에 최소 15분 동안 코팅된 플레이트를 37°C에서 배양합니다.
3. 소화되지 않은 조직, 적혈구 용해 및 세포 도금의 여과
- 1.5단계에서 조직 균질액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 6mL로 플레이트를 한 번 세척하여 나머지 세포를 이동합니다.
- 70μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 균질액을 50mL 원뿔형 튜브로 여과하여 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 변형된 세포를 500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 10x RBC 용해 완충액을 멸균 dH2O에 희석하여 1x 작업 용액을 만듭니다.
- 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 10mL의 1x RBC 용해 완충액에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 37°C에서 5분간 배양합니다.
- 20–25mL의 DPBS를 첨가하여 RBC 용해 완충액을 중화하고 타액 세포의 용해를 최소화합니다. 500 x g.
에서 5분 동안 원심분리기
메모: RBC 용해 완충액으로 처리한 후 세포 펠릿은 흰색이어야 합니다. 펠릿의 빨간색은 모든 적혈구가 완전히 용해되지 않았음을 나타냅니다. 모든 적혈구의 완전한 용해를 위해 필요한 경우 3.4-3.5단계를 반복합니다.
- 상층액을 흡인합니다. 웰당 1-2mL의 BEGM에 펠렛을 재현탁시킨 다음 부유 세포를 BMM 코팅된 웰에 놓습니다. 37°C에서 배양합니다.
- BMM에 도금되면 세포는 2-3일에 걸쳐 구형 구조 또는 "살리스피어(salispheres)"로 형성됩니다. 세포는 BMM이 분해되기 시작하기 전에 약 5-7일 동안 살리스피어로 유지될 수 있으며, 이를 통해 세포가 플라스틱에 접근하고 부착하여 단층으로 성장할 수 있습니다.