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1. 나노 입자 프로브의 제조
참고: 이 분석은 뉴트라비딘 폴리머(AV)와 공유 결합되고 DFM 조명 시 적색(641nm 피크) 산란 신호를 생성하는 표면 플라즈몬 공명 피크를 갖는 기능화 금 나노로드(AuNR, 25nm 직경 x 71nm 길이)를 사용합니다.
- 40 μL의 AuNR-AV(2.56 x 1011 입자)를 200 μL PBS(pH 7.0)로 원심분리 및 흡인(8,500 x g, 4°C에서 10분 동안 10분)으로 3회 세척한 다음 최종 원심분리 및 흡인 단계를 거친 후 AuNR-AV 펠릿을 40 μL PBS에 현탁시킵니다.
- 이 AuNR-AV 현탁액을 관심 엑소좀 아형 표면의 항원에 특이적인 10μL 비오틴화 항체(0.5mg/mL) 및 150μL의 PBS와 혼합한 다음 믹서를 사용하여 4°C에서 2시간 동안 혼합하여 뉴트라비딘-비오틴 결합이 완료될 수 있도록 합니다.
- 생성된 항체 접합 AuNR(AuNR-IgG)을 원심분리 및 흡인(6,500 x g, 4°C에서 10분 동안 10분)으로 3회 세척한 다음 200μL PBS에 현탁하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
메모: AuNR-IgG의 오염 및 분해를 방지하기 위해 멸균 기술과 짧은 보관 시간을 사용해야 합니다. 항체 접합 AuNR은 접합 후 24시간 이내에 사용하는 것이 가장 좋습니다.
2. EV 캡처 슬라이드 준비
- 선택된 엑소좀 포집 항체를 PBS에서 0.025mg/mL로 희석하고 이 희석액 중 1μL/웰을 멀티웰 단백질 A/G 슬라이드에 첨가한 다음 이 슬라이드를 가습 챔버에서 1시간 동안 37°C에서 배양하여 슬라이드에 고정된 단백질 A/G에 대한 포획 항체 결합을 허용합니다.
- 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 웰을 흡인하고 PBS 1 μL/웰을 첨가 및 흡인하여 3회 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 1μL의 차단 버퍼(재료 표 참조)를 로드하고 가습된 챔버에서 37°C에서 2시간 동안 슬라이드를 배양하여 남아 있는 단백질 결합 부위를 차단합니다.
- 웰을 흡입하여 블로킹 버퍼를 제거하고, 1 μL/웰의 PBS를 첨가 및 흡인하여 웰을 3회 세척한 다음, 엑소좀 포획 및 분석을 위해 블로킹된 슬라이드를 즉시 사용합니다.
3. 표준 곡선 준비
- 특정 엑소좀 아형의 절대적 또는 상대적 존재량을 정확하게 정량화하기 위해, 사용자는 관심 있는 엑소좀 표면 바이오마커를 균일하게 발현하는 순수 엑소좀 집단으로 표준 곡선을 생성해야 합니다. 이 연구는 전이 관련 막 단백질인 Ephrin A2 receptor를 발현하는 엑소좀의 풍부함을 분석하며, 이는 췌장암 병기 및 예후와 관계가 있는 것으로 보고되었습니다.
메모: 인간 췌장암 세포주 PANC-1과 그 엑소좀은 이 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있으며, 이 세포주에서 분리한 엑소좀을 사용하여 복합 엑소좀 샘플에서 이 단백질을 발현하는 엑소좀의 수를 정량화하기 위한 표준 곡선을 생성했습니다.
무- 혈청 배양 배지에서 37°C에서 48시간 동안 세포를 배양하여 배지에 엑소좀이 축적될 수 있도록 한 다음, 현탁 배양의 원심분리를 통해 세포 배양 상등액을 분리하거나 부착 세포 배양에서 배양 배지를 직접 흡인합니다.
- 수집된 매체를 2000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 파편을 제거하고 상층액을 회수합니다.
- 적절한 용량의 0.45μm 저단백질 결합 필터 장치(예: 250mL 폴리에테르 설폰 진공 여과 장치)를 통해 정화된 배양 상층액을 여과합니다.
- 100,000 공칭 분자량 제한 필터 시스템을 사용하여 3200 x g에서 원심분리를 통해 생성된 여과액을 250 μL의 최종 부피로 농축합니다. 이 필터에서 잔류 부피를 수집한 다음 200μL PBS로 필터를 세척하고 이 세척량을 수집된 엑소좀 샘플 부피와 결합합니다.
- 이 샘플을 21,000 x g에서 45분 동안 원심분리하고 침전된 물질이 수집되지 않도록 주의하면서 상층액을 조심스럽게 회수합니다.
- 회수된 상층액을 100,000 x g에서 3시간 동안 원심분리하여 엑소좀을 침전시킵니다. 상층액을 흡인하고 엑소좀 펠릿을 100μL PBS에 수집합니다.
- 생성된 엑소좀 현탁액은 24시간 이내에 사용하는 경우 4°C, 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관하십시오.
참고: 엑소좀 샘플을 동결-해동 주기를 반복하지 마십시오.
- 엑소좀 수치를 직접 측정하여(예: 나노입자 추적 분석 또는 조정 가능한 저항 펄스 감지를 이용하거나, 마이크로-비신초닌산 분석 또는 이에 상응하는 방법으로 엑소좀 농도를 측정하여 엑소좀 수량을 근사화하기 위한 수단으로) 혼합 후 엑소좀 현탁액의 분취량을 정량화합니다.
- 엑소좀 현탁액의 연속 희석 세트를 생성하여 나노 입자 신호를 비교하여 엑소좀 수 또는 단백질 함량을 입력할 수 있습니다.
- 각 엑소좀 표준물질 1μL를 분석 플레이트의 각 복제 웰로 옮깁니다.
참고: 표준 곡선을 사용하여 나노입자 신호와 엑소좀 농도 사이의 상관선 기울기를 계산하여 (1) 분석 성능을 평가하고 (2) 실험 샘플에서 타겟 엑소좀의 상대 농도를 결정할 수 있습니다.
4. 인간 혈장 또는 혈청 샘플 처리
- 표준 방법으로 혈장 또는 혈청 샘플을 수집하고 엑소좀 분석에 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 실온 수조에서 샘플을 빠르게 해동합니다. 균일한 현탁액을 촉진하기 위해 반전으로 해동된 샘플을 반복적으로 혼합합니다.
참고: 혈청 및 혈장 샘플의 결과는 응고 반응 중에 엑소좀이 크게 방출되기 때문에 동일하지 않을 수 있습니다.
- 500 x g에서 15분 동안 혈장 또는 혈청 시료를 원심분리하여 단백질 응집체 및 기타 파편을 침전시킵니다. 혈장 또는 혈청 샘플의 부분 표본을 새 튜브로 옮기고 PBS를 첨가하여 1:1 희석액을 생성합니다. 희석된 샘플을 적절하게 부드러운 와류 또는 반전으로 혼합합니다. 각 혈장 또는 혈청 현탁액 1μL를 분석 플레이트의 각 복제 웰로 옮깁니다.
5. 엑소좀 포획 및 검출
- 샘플당 8회 복제를 사용하여 차단된 EV 캡처 슬라이드의 웰에 1μL/웰의 엑소좀 샘플을 로드하고 가습 챔버에서 4°C의 하룻밤 동안 슬라이드를 배양합니다. 모든 샘플 웰을 흡입한 다음 1μL/웰의 PBS를 첨가하여 웰을 세척하고 로드된 엑소좀 샘플에서 결합되지 않은 엑소좀 및 기타 오염 물질을 제거합니다.
- 이전에 준비된 AuNR-IgG 현탁액(위의 섹션 1 참조)의 1μL/웰로 샘플 웰을 로드하고 가습 챔버에서 37°C에서 2시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 나노 입자 용액을 흡입하고 믹서를 사용하여 0.01% Tween-20(PBST)이 보충된 PBS에서 슬라이드를 10분 동안 세척한 다음 회전 믹서를 사용하여 10분 동안 모든 샘플 웰을 탈이온수로 흡인 및 세척하고 후속 LMDFM 이미지를 위해 자연 건조합니다.
참고: Inter-assay coefficients of variation(CV)는 동일한 샘플의 8회 반복에서 평가됩니다. CV가 >20%인 샘플은 정보가 없는 것으로 간주되며 충분한 샘플이 있는 경우 반복해야 합니다.