쥐에서 온전한 신장 추출: 쥐 모델에서 신장 캡슐 없이 신장을 얻는 기술

초록

출처: Grainger, N. et al. Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning. J. Vis. 특급. (2021년)

이 비디오에서는 마우스의 후복막 공간에서 신장을 추출하는 절차를 설명합니다. 추출된 신장을 더 미세절개하여 신낭과 주변 지방층이 없는 온전한 신장을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 신장 박리

1. 환기 후드에서 3-4% 이소플루란을 흡입하여 마우스를 마취합니다. 발가락 및/또는 꼬리 꼬집 반사의 상실에 의한 심부 마취 유도를 확인한 다음 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.
2. 가슴에 에탄올 70%를 바르면 털이 적신다.외부 박리 가위를 사용하여 세로 절개를 통해 복강을 열고 가위날을 동물로부터 멀어지게 하여 내부 장기의 손상을 방지한다.
3. 내부 조직 겸자와 내부 해부 가위를 사용하여 장을 꼬집고 복벽에서 들어 올립니다. 장을 들어 올리는 동안 근위 십이지장과 원위 결장에서 몸에서 벗어나 장의 아래쪽을 잘라내어 신장을 포함하는 후복막 공간에 접근합니다.
4. 신장이 노출되면 개별적으로 추출합니다. 조직 겸자로 요관의 말단부(신장에서 ~4mm 거리)를 부드럽게 꼬집고 들어 올립니다. 해부 가위를 사용하여 꼬집힌 요관 아래를 신장 쪽으로 자릅니다. 신장이 주변 결합 조직에서 분리될 때까지 신장 아래를 계속 절개합니다.
   메모: 진동 절편 중 조직의 무결성과 절단 일관성을 최대화하려면 신장이 가능한 한 손상되지 않은 상태여야 합니다. 이를 위해 집게와 해부 가위로 신장을 꼬집거나 자르지 마십시오.
5. 요관이 부착된 신장을 얼음처럼 차가운 KRB 용액에 넣습니다. 반대쪽 신장으로 추출 단계를 반복하여 마우스의 몸에서 제거합니다. 얼음에 KRB 용액의 신장을 유지하십시오.
   참고: PKJ 조직 생존력을 보존하기 위해 프로토콜의 다음 섹션으로 즉시 진행하십시오. 신장 실질 깊숙한 곳에 있는 해부학적 위치 때문에 PKJ는 KRB 용액과의 접촉이 박탈됩니다.

2. 진동 절편을 위해 신장 캡슐이 없는 신장을 준비

합니다.

1. 신장을 실리콘 엘라스토머로 코팅된 박리 접시(60mm x 15mm)에 옮기고 신장이 완전히 잠길 때까지 얼음처럼 차가운 KRB 용액으로 채웁니다.
2. 해부 현미경으로 근위 요관과 얇은 전방신낭 또는 주변 지방 조직을 통해 minutien 핀을 삽입하여 신장을 접시 바닥에 고정합니다.
   메모: 신장 실질 조직에 구멍을 뚫지 않도록 주의한다.
3. 가는 스프링 가위와 내부 집게를 사용하여 신장 기저부의 지방 조직을 제거하여 원위 RP와 근위 요관을 노출시킵니다.
4. 가는 스프링 가위를 사용하여 RP 기저부에서 근위 요관과 원위 RP의 일부를 제거합니다.
   메모: 주변 신장 실질이 절단되지 않도록 주의하십시오. 그림 1A의 검은색 점선은 이 절단의 대략적인 위치를 나타냅니다. 이 절단은 보다 균일한 조직 절편을 위해 신장에 평평한 바닥을 만듭니다. 신장을 절개할 때는 PKJ 영역의 해부학적 위치를 알고 있어야 합니다. 그림 1B는 온전한 신장을 시상면을 따라 절단하여 수질, 유두(유두(유두), 근위부 및 원위 RP를 노출시킬 수 있음을 보여줍니다. 그림 1C와 같이 유두가 완전히 노출되면 PKJ 및 근위 RP(prox RP)를 시각화할 수 있습니다. 그러나 비브라톰 기술에 대해서는 이렇게 해서는 안 됩니다. 이 설명은 독자를 일반적으로 PKJ 위치로 안내하기 위한 것이며, 도 1D, E에서 PKJ 영역과 mid-RP 영역의 투과광 이미지에 나타난 해부학적 차이에서 강조됩니다.
5. 가는 끝 집게로 바깥쪽 신낭을 뚫고 끝을 신장체에서 멀어지게 합니다. 양손으로 집게를 사용하여 캡슐의 느슨한 끝을 꼬집어 떼어냅니다. 완전히 제거될 때까지 남아 있는 신낭 막을 계속 벗겨냅니다.
   메모: 신낭은 신장을 둘러싸고 있는 단단하고 섬유질이 많은 층입니다. 최적의 절단을 위해 진동 절편 전에 제거해야 합니다.

결과

그림 1: 기본 신장 해부학적 구조 및 PKJ 심박 조율기 부위의 위치.(A) RP와 요관의 방향을 보여주는 온전한 신장의 다이어그램. 신장 동맥과 신장 정맥은 각각 빨간색과 파란색으로 표시됩니다. (B) 온전한 신장을 시상면을 따라 절단하여 수질, 유두(유두(유두, 채취관이 수렴하는 원위 수질), 근위 및 원위 RP를 포함한 신장의 내부 측면을 노출시킬 수 있습니다. (C) 수질과 유두를 절제하여 PKJ와 prox RP를 완전히 노출시킬 수 있습니다. (D 및 E)는 각각 PKJ 심박 조율기 영역과 원위 RP에서 투과된 광 이미지를 나타냅니다. 골반의 말단부를 향해 순...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
60mm x 15mm 페트리 접시	시그마 알드리치	P5481	신장 날카로운 해부 접시
흡수성 종이	피셔 사이언티픽	06-666ᅡ	바르기 전에 신장을 말리려면 풀
나6; 129S-GT(로사)26소어/J	잭슨 연구소	13148	GCaMP3 마우스
나6; 129S-GT(로사)26소어/J	잭슨 연구소	24105	GCaMP6f 마우스
나6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	잭슨 연구소	19079	smMHC-CRE 마우스
C57BL/6-TG(Pdgfra-cre)1Clc/J	잭슨 연구소	13148	PDGFRa-CRE 마우스
에탄올	팜코-아페르	재질 보기 SDA 2B-6	해부용
극세 본 가위	정밀 과학 도구	14083-08	내부 해부 가위에 사용
가는 가위	정밀 과학 도구	14060-09	외부 해부 가위에 사용
가는 팁 겸자	정밀 과학 도구	11254-20	신장의 미세 절개에 사용
이소플루란	백스터	NDC 1001936060	마취용
실리콘 엘라스토머	피셔 사이언티픽	NC9285739	실가드 184
학생 Adson 집게	정밀 과학 도구	91106-12	부드럽게 잡고 움직이기 위해 신장
학생 Dumont 집게	정밀 과학 도구	91150-20	내부 해부 겸자에 사용
Vannas 스프링 가위	정밀 과학 도구	15000-03	의 날카로운 해부 및 청소를 위해 고립된 신장

(영문) 년 호 년 년 년 년 년 년 년 년