전체 쥐 신장의 진동 절편: 쥐 신장의 얇은 절편을 생성하는 기술

초록

출처: Grainger, N. et al. 진동 절편에 의한 마우스 신장 골반의 온전한 실시간 심박 조율기 영역 분리 및 이미징. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 얇은 절편을 얻기 위해 전체 마우스 신장의 진동 절편을 보여줍니다. 이러한 절편화된 조직 절편은 추가 다운스트림 분석이 있을 때까지 저온에서 보관할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 120.35 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 15.5 mM NaHCO₃, 1.2 mM Na₂HPO 4,1.2 mM MgCl₂, 11.5 mM 포도당 및 2.5 mM CaCl 2를 포함하는 Krebs-Ringer Bicarbonate₍KRB) 용액 1 L를 준비합니다. 사용 당일에는 KRB 솔루션을 ice.
   에서 유지 관리하십시오. 메모: KRB는 4°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있으며 사용하기 최소 10분 전에 97% O₂ 및 3% CO₂를 혼합하여 미리 거품을 일으켜야 합니다.

2. 신장의 진동 절편

1. 끝이 뭉툭한 집게를 사용하여 얼음처럼 차가운 KRB 용액에서 준비된 신장을 부드럽게 잡고 제거합니다. 즉시 신장을 흡수성 종이에 ~2-4초 동안 올려 놓아 과도한 외부 수분을 제거합니다. 신장을 흡수지에 부드럽게 굴려 실질의 모든 면이 건조되어 신장이 진동 단계에 최적으로 접착되도록 합니다.
   참고: 신장 골반은 신장 내부에 위치하고 있으므로 외부 실질에 의해 보호되기 때문에 이 짧은 건조 기간은 조직 무결성에 해롭지 않습니다.
2. 즉시 비브라톰 표본 플레이트의 바닥에 시아노아크릴레이트 접착제(~1cm²)의 얇은 층을 바르고 뭉툭한 집게를 사용하여 접착제로 덮인 부위에 요관 쪽이 아래를 향하게 하여 신장을 놓습니다. 약 10-20초 동안 집게의 평평한 가장자리로 신장 상단에 아래쪽 압력을 부드럽게 가하여 접착제를 건조시킵니다.
   메모: 이 절차를 수행하는 동안 신장을 안정시키려면 접착제가 건조될 때 신장을 똑바로 세울 수 있도록 추가 집게를 사용하십시오. 신장이 표본 플레이트에 똑바로 세워 절단되어 절편이 똑바로 절단되도록 하는 것이 중요합니다. 신장이 표본 플레이트에 성공적으로 부착되었는지 확인하려면 신장 측면을 부드럽게 밉니다. 신장이 플레이트에 성공적으로 부착되면 신장의 기저부가 플레이트에 고정된 상태로 유지되어야 합니다.
3. 표본 플레이트를 버퍼 트레이 바닥에 단단히 고정합니다. 신장 상단이 완전히 잠기도록 KRB 용액의 수준을 조정합니다. 절편 단계에서 비브라톰 블레이드가 버퍼 트레이 깊숙이 들어가면 블레이드 홀더가 용액에 잠기지 않도록 KRB 용액을 제거합니다.
   메모: 이 단계를 진행하기 전에 접착제가 완전히 건조되지 않은 경우 접착제는 종종 기저부에서 신장 실질로 이동합니다. 이 과도한 접착제는 단면을 더 다양하게 만듭니다. 이 경우 플레이트에서 신장을 제거하고 새로운 신장 준비를 진행하십시오.
4. 자동 비브라톰 절단의 경우 비브라톰 블레이드 절단 사이클의 시작 및 끝 위치를 선택합니다. 이러한 위치가 신장에서 ~0.5–1cm 떨어져 있는지 확인하여 각 블레이드 전진으로 전체 신장 평면이 절단되었는지 확인합니다.
5. KRB 용액으로 웰을 채워 멀티웰 플레이트(24 또는 48웰)를 준비하고 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.
   메모: 생성되면 개별 섹션을 별도의 웰에 배치하여 섹션 깊이를 추적해야 합니다.
6. 자동 절단 프로세스를 시작합니다. 칼날을 처음 통과하는 동안 칼날이 신장 상단과 접촉하는지 확인하십시오. 접촉이 이루어지지 않으면 블레이드의 시작 Z 위치를 조정하십시오.
7. 겸자를 사용하여 신장에서 분리된 부분을 수집합니다. 즉시 절편을 개별 웰로 옮기고 절편의 Z-깊이를 기록하여 신장 절편 내 대략적인 PKJ 위치를 측정합니다.
   메모: 절단 매개변수에 따라 일부 섹션이 신장 블록에서 절단되지 않을 수 있습니다. 이 경우 가는 스프링 가위를 사용하여 신장 블록의 일부를 조심스럽게 잘라냅니다. 또한 사용자는 최적의 절단 설정과 조직 위치를 보장하기 위해 개별 웰에서 자유롭게 떠다니는 동안 광학 현미경으로 단면을 적극적으로 시각화하는 것이 좋습니다. PKJ를 포함하는 절편은 일반적으로 신장 상단에서 ~ 1000–1500μm에서 파생됩니다.
8. PKJ 영역이 더 분명해질 때까지 절편 프로토콜을 계속합니다. 단면화가 진행됨에 따라 PKJ 지역에 대한 설명은 대표적인 결과 섹션을 참조하십시오.
9. 이 시점에서 절편 매개변수를 최적화하여 절편이 신장 블록에서 균일하게 분리되고 손상되지 않도록 합니다. 또한 깨진 PKJ 벽은 붕괴로 인해 벽 내 세포의 적절한 이미징을 허용하지 않으므로 PKJ 영역이 연속적이고 끊어지지 않았는지 확인하십시오. 벽이 파손되면 단면 속도를 줄이고 단면 두께를 늘리고 광학 현미경으로 단면을 계속 관찰하여 절단 매개변수를 미세 조정하십시오.
10. 실험이 시작될 때까지 KRB 용액에 절편을 4°C로 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 배양 플레이트	써모피셔 사이언티픽	142485	신장 조각을 보관하기 위해
48웰 배양 플레이트	써모피셔 사이언티픽	152640	신장 조각을 보관하기 위해
흡수성 종이	피셔 사이언티픽	06-666ᅡ	접착제를 바르기 전에 신장을 말리려면
시아노아크릴레이트 접착제	아마존	B001PILFVY	신장을 검체 플레이트에 부착하기 위해
나6; 129S-GT(로사)26소어/J	잭슨 연구소	13148	GCaMP3 마우스
나6; 129S-GT(로사)26소어/J	잭슨 연구소	24105	GCaMP6f 마우스
나6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	잭슨 연구소	19079	smMHC-CRE 마우스
C57BL/6-TG(Pdgfra-cre)1Clc/J	잭슨 연구소	13148	PDGFRa-CRE 마우스
가는 팁 겸자	정밀 과학 도구	11254-20	신장의 미세 절개에 사용
질레트 실버 블루 양날 블레이드	아마존	B009XHQGYO	비브라톰의 블레이드 홀더에 삽입하기 위해
학생 Adson 집게	정밀 과학 도구	91106-12	신장을 부드럽게 잡고 움직이기 위해
학생 Dumont 집게	정밀 과학 도구	91150-20	내부 해부 겸자에 사용
바이브로체크	라이카	14048142075	절단 중 블레이드 움직임을 교정하기 위한 선택적 구성 요소
VT1200 S 진동 블레이드 마이크로톰	라이카	14912000001	구성 1은 프로토콜에서 사용됩니다.

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