방광 종양 오가노이드 모델: 방광 오가노이드를 수용자 쥐 방광에 정소성 이식하는 방법

초록

출처: Kim, Y. et al. 마우스 방광 종양 오가노이드의 배양, 조작 및 정소이식.J. Vis. 특급(2020년)

이 비디오에서는 종양 발생에 대한 장기 환경의 역할을 연구하기 위해 배양된 방광 종양 오가노이드를 쥐 방광에 정소성 이식하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 아배양 방광 종양 오가노이드
 

참고: 방광 종양 오가노이드는 직경이 100–150μm에 도달할 때 통과시키는 것이 좋습니다.

1. 종양 오가노이드가 있는 24웰 플레이트의 오가노이드 배지에 500μL의 콜라겐분해효소/디스페이아제를 추가합니다. 피펫은 기저막 매트릭스와 매체를 위아래로 움직입니다. 37°C에서 20분 동안 배양하고 세포를 15mL 튜브로 수확합니다.
   메모: 현미경으로 기저막 매트릭스에서 분리된 오가노이드를 검사합니다. 오가노이드가 기저막 매트릭스에서 분리되지 않으면 배양 시간을 늘리거나 피펫을 더 많이
주입합니다.
2. 예열된 DMEM 5mL를 넣고 400 x g에서 4°C에서 3분 동안 튜브를 원심분리한 다음 상등액을 흡인합니다.
3. 예열된 0.25% 트립신-EDTA 1mL와 10μM Y-27632를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 37°C 수조에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 위아래로 격렬하게 피펫팅하고 10% FBS가 포함된 DMEM 5mL를 사용하여 트립신을 중화합니다.
4. 튜브를 400 x g에서 4°C에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
5. 1mL의 예열된 오가노이드 배지를 사용하여 펠릿을 재현탁하고 단일 종양 세포의 수를 계산합니다.

2. 방광 오가노이드의 정소성 이식(그림 1A)

1. 정립성 이식을 위한 방광 종양 오가노이드 준비
   1. 이식 전에 위에서 설명한 대로 5-7일 동안 방광 종양 오가노이드를 배양합니다.
   2. 500μL의 콜라겐분해효소/디스페이아제를 종양 오가노이드가 있는 24웰 플레이트의 오가노이드 배지에 추가합니다. 피펫은 기저막 매트릭스와 매체를 위아래로 움직입니다. 37°C에서 20분 동안 배양하고 세포를 15mL 튜브에 모읍니다.
   3. 예열된 DMEM 5mL를 추가하고 400 x g의 튜브를 4°C에서 3분 동안 원심분리한 다음 상층액을 흡입합니다.
   4. 펠릿을 1mL의 DMEM으로 재현탁시키고 용액을 90mm 페트리 접시에 옮깁니다.
   5. 현미경으로 P200 마이크로피펫을 사용하여 10-100개의 종양 오가노이드를 채취하여 얼음 위의 마이크로튜브에 수집합니다.
   6. 튜브를 400 x g에서 4°C에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 버립니다.
   7. 생쥐가 수술할 준비가 될 때까지 세포 펠릿을 얼음 위에 유지합니다.
2. 점막하 방광 벽 이식
   1. 8-10주 된 수컷 누드 마우스(CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl)가 새로운 환경에 적응할 수 있도록 실험 최소 1주일 전에 준비합니다. 수술 24시간 전에 엔로플록사신(5mg/kg)을 피하주사합니다.
   2. 비누와 물로 벤치 표면을 청소하십시오. 수술 전에 수술 기구를 고압증기멸균하고 멸균 기구를 사용하여 수술을 수행합니다.
   3. 29G 인슐린 주사기, 피펫 팁 및 기저막 매트릭스를 얼음 위에 보관하십시오. 마취 투여 전에 케토프로펜(5mg/kg)을 피하로 투여합니다.
   4. 유도 챔버에서 4% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 전신 마취가 완료되면 마우스를 누운 자세로 눕히고 2% 기화된 이소플루란을 마스크 흡입으로 마취를 유지합니다.
      메모: 마취 시간이 30분 이상인 경우 각막이 건조되지 않도록 면봉을 사용하여 양쪽 눈에 안연을 도포합니다.
   5. 포비돈 요오드를 멸균 거즈로 바르고 70% 에탄올로 닦아냅니다. 매번 새 거즈나 면봉으로 3회 반복합니다.
   6. 일회용, 멸균 수술용 드레이프를 사용하여 항문과 수술 부위를 덮으십시오.
   7. 확대용 해부 현미경을 사용하여 멸균 수술용 가위로 하정중선 복부의 피부와 근육 벽을 작은 가로 절개(1.5cm 미만)합니다. 복강에서 방광을 노출시키고 식염수를 적신 면봉으로 방광을 지지합니다.
      메모: 방광에 소변이 가득 차면 방광을 부드럽게 눌러 약간 감압합니다.
   8. 50% 고농도 기저막 매트릭스를 포함하는 80μL의 오가노이드 배지에 오가노이드 펠릿을 재현탁합니다(표 1 및 재료 표).
   9. 해부 현미경으로 29G 인슐린 주사기를 사용하여 오가노이드 현탁액을 방광 돔의 앞쪽에 주입합니다.
   10. 항균 흡수성 봉합사로 복벽의 내층을 닫은 다음 4-0 나일론 봉합사로 바깥층을 닫습니다. 포비돈 요오드와 70% 에탄올로 수술 부위를 소독합니다.
   11. 마우스가 적외선 조사기 아래에서 10-15분 동안 회복할 때까지 마우스가 의식과 운동성을 회복할 때까지 모니터링합니다.
   12. 수술 후 하루 만에 마우스의 일반적인 상태와 문합 누출을 확인하십시오. 케토프로펜(5mg/kg)을 수술 후 3일 동안 하루 1회 투여하고 엔로플록사신(5mg/kg)을 수술 후 10일 동안 1일 1회 투여합니다.
   13. 절개 부위가 치유되면(수술 후 10-14일) 봉합사를 제거합니다. 종양 오가노이드 주사 후 2-3주 동안 마우스 방광 종양의 성장을 모니터링합니다.
   14. 방광 종양 성장이 관찰되면 이산화탄소 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 방광 종양 전체를 채취합니다. 차가운 DPBS를 사용하여 세척하십시오(그림 1B).
   15. 방광 종양 조직학을 분석하기 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 조직의 파라핀 함유 부분을 염색합니다(그림 1B).

마우스 방광 종양 오가노이드 매체
고급 DMEM/F-12(기본 매체)	10mM 헤페스(pH 7.4)
10mM 니코틴아미드	0.5x 무혈청 보충제
2mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드	1% 페니실린/스트렙토마이신
1mM N-아세틸-L-시스테인	50ng/mL 쥐 표피 성장 인자
재질 보기 1μM A 83-01

표 1: 방광 종양 오가노이드 배지의 구성.

결과

그림 1: 방광 종양 오가노이드의 정소성 이식.(A) 방광 종양 오가노이드를 누드 마우스에 이식하는 정형소 이식의 개략도. (B) 방광 종양 오가노이드를 정교 이식한 마우스의 방광 및 H&E 염색 절편의 대표 이미지. 가운데 패널에 있는 상자 영역의 확대 보기가 왼쪽 패널에 표시됩니다. 눈금 막대 = 500μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15mL 코니컬 튜브	증권 시세	50015
24웰 플레이트	코 닝	3526
인슐린 주사기 1/2개 29G	시나	B299473538
50mL 코니컬 튜브	증권 시세	50050
A8301	토크리스	2939	재고 농도: 25 mM
앱솔루트 에탄올	대정광역시	4023-2304
흡수성 봉합사	헨리 샤인	제039010
고급 DMEM/F-12	열	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/crl (누드 마우스)	찰스 리버	194
콜라겐분해효소 I형	열	17100017	재고 농도: 20 mg/mL
콜라겐분해효소 II형	열	17100015	재고 농도: 20 mg/mL
콜라겐 분해 효소 / 디스 페이 아제	시그마	10269638001	재고 농도 : 1 mg / mL
DMEM(Dulbecco의 수정된 최소 필수 매체)	지브코	11965-118
DMSO(디메틸설폭사이드)	시그마	D8418
DPBS(둘베코의 인산염 완충 식염수)	웰진	LB 001-02
마트리겔 성장 인자 감소(GFR) 성장 인자 감소(GFR)	코 닝	제354230	플레이트의 오가노이드 배양에 사용
Matrigel 고농도(HC)	코 닝	354248	오가노이드 이식에 사용
1.5 mL 마이크로튜브	액시겐	MCT-150-C
면도날
식염수 완충액	JW중외제약
트립신-EDTA (0.25%)	지브코	25200072
초원심분리 튜브	벡크만 쿨터	331372
Y-27632 이염산염	압몰레	M1817	재고 농도: 10mM

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