고체상 미세추출 시료 채취: 이식편 조직에서 시료 추출을 위한 프로브 기반 기법

초록

출처: Stryjak, I. et al. 이식 품질 평가를 위한 화학 생검 사용. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오에서는 사전 적출된 기증자 신장에서 SPME 프로브 기반 대사 산물 추출을 보여줍니다. 추출된 대사 산물은 이식을 위한 장기 품질을 평가하기 위해 대사체 및 지질체 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 프로브 준비

1. 7mm 혼합 모드 흡착제로 코팅된 티타늄-니켈 합금 프로브(길이 40mm, 직경 0.2mm)를 준비합니다. 프로브 수는 전체 절차에서 대상으로 하는 시점과 반복 횟수(시점당 3회 권장)에 따라 다릅니다.
   메모: 추출 단계의 길이와 유형은 연구 모드, 대사 산물의 극성 및 샘플 매트릭스에 따라 조정될 수 있습니다.
2. 2:1 클로로포름:메탄올(v/v)로 구성된 세척 혼합물을 준비합니다. 용액 1.0mL를 각 2.0mL 유리 바이알에 피펫팅하고 이전에 캡을 뚫은 프로브 하나를 각 바이알에 넣습니다.
   메모: 사용하기 전에 모든 프로브를 청소하여 오염 입자를 제거하십시오.
3. 바이알을 교반기에 놓고 교반 속도를 1,200rpm으로 설정합니다. 45분 후 장치를 중지하고 LC-MS 등급의 물로 코팅을 헹굽니다.
4. 코팅은 코팅을 활성화하기 위해 사전 컨디셔닝 단계를 거쳐야 하므로 1:1 메탄올:물(v/v)로 구성된 프리컨디셔닝 혼합물을 준비합니다. 용액 1.0mL를 각 2.0mL 유리 바이알에 피펫팅하고 각 바이알에 미리 캡을 뚫은 프로브 1개를 넣습니다.
5. 바이알을 와류 교반기에 놓고 교반 속도를 1,200rpm으로 설정합니다.
6. 60분 후 교반기를 멈추고 LC-MS 등급의 물로 코팅을 헹굽니다.
7. 표준 수술 장비 멸균 프로토콜에 따라 프로브를 멸균합니다.

2. 추출

1. 멸균 환경을 보장하기 위해 샘플링 직전에 멸균 패키지를 개봉하십시오.
2. 각 시점에서 10분 동안 두 개의 프로브를 신장 피질에 직접 삽입합니다. 코팅의 전체 길이는 조직 매트릭스로 덮여야합니다. 특정 각도는 필요하지 않지만 일반적으로 약 90도가 사용됩니다.
   메모: 전체 의료 절차는 해당 기관의 표준 프로토콜을 따릅니다. SPME 샘플링과 관련된 수정은 고려되지 않습니다. 이 절차에는 다음과 같은 6가지 샘플링 시점이 포함됩니다: a) 신장 절제 전, 기증자로부터 생체 내; b)–e) 신장 관류 1시간, 3시간, 5시간, 7시간 후, 장기실에서 생체 외; f) 재관류 후, 수용자로부터 생체 내.
3. 프로브를 조직에서 빼내어 수축시킨 다음 LC-MS 등급의 물로 코팅을 헹구어 코팅 표면에 남아 있는 혈액을 제거합니다. 수술 부위를 헹구고 프로브를 제거한 직후에 헹굽니다.

3. 운송 및 보관

1. 프로브를 별도의 바이알에 넣고 닫습니다.
2. 바이알을 드라이아이스로 채워진 스티로폼 상자 또는 액체 질소에 넣어 운반합니다.
3. 샘플을 냉동고(-80 °C)에 보관하거나 즉시 탈착 단계를 시작하십시오.

4. 탈착

1. 대사체 분석을 위한 80:20 아세토니트릴:물(v/v)과 지질체 분석을 위한 1:1 이소프로판올:메탄올(v/v)로 구성된 탈착 용액을 준비합니다.
2. 용액 100μL를 2.0mL 라벨이 붙은 바이알에 삽입물로 피펫팅하고 각 바이알에 이전에 캡을 뚫은 프로브 하나를 배치합니다.
3. 바이알을 와류 교반기에 놓고 교반 속도를 1,200분 동안 120rpm으로 설정합니다.
4. 바이알에서 프로브를 제거합니다. 얻은 추출물은 이제 기기 분석을 위한 준비가 되었습니다.

5. LC-MS 분석

1. 추출물이 들어있는 바이알을 LC-MS 시스템의 자동 시료 주입기에 놓습니다.
   메모: 이 연구에는 고분해능 질량 분석법과 결합된 액체 크로마토그래피(RP, HILIC) 및 Orbitrap 질량 분석기가 사용되었습니다. 대사체 분석 파라미터의 경우 5.2단계로 이동합니다. 지질체학 분석 파라미터의 경우 5.6단계로 이동합니다.
2. 역상 분리를 위해 펜타플루오로페닐(PFP) 컬럼(2.1mm x 100mm, 3μm)을 사용합니다.
   1. 유속을 300μL/min으로 설정하고 자동 시료 주입기 및 컬럼 온도를 각각 4°C 및 25°C로 설정합니다.
   2. 이동상 A: 물:포름산(99.9:0.1, v/v) 및 이동상 B: 아세토니트릴:포름산(99.9:0.1, v/v)의 비율에 따라 이동상을 준비합니다. 다음 매개변수에 따라 이동상 흐름을 설정합니다: 100% A 시작 후 10% A(3-25분)로 선형 그래디언트, 34분까지 10% A의 등용매 흐름으로 끝, 6분의 컬럼 재평형 시간
3. HILIC 분리의 경우 HILIC 컬럼(2.0mm x 100mm, 3μm, 200A)을 사용합니다. 유속을 400μL/min으로 설정합니다.
   1. 다음 비율에 따라 이동상을 준비합니다: 이동상 A: 아세토니트릴:암모늄 아세테이트 완충액(9:1, v/v, 유효 염 농도 20mM), 이동상 B: 아세토니트릴:암모늄 아세테이트 완충액(1:1, v/v, 유효 염 농도 20mM).
   2. 다음 매개변수에 따라 이동상 흐름을 설정합니다: 100% A에서 이동상 흐름(0-3분)을 시작하고 3.0분 동안 유지한 다음 5분 이내에 100% B로 램프합니다. 12분까지 100% B로 유지한 다음 8분 동안 컬럼 재평형 시간을 유지합니다.
4. 스캔 범위를 85–1000m/z로 설정합니다. 양이온화 모드에서 HESI 이온 소스 매개변수를 스프레이 전압 1,500V, 모세관 온도 300°C, 시스 가스 40aU, 보조 가스 유량 15au, 프로브 히터 온도 300°C, S-렌즈 RF 레벨 55%로 설정합니다.
5. 분석된 각 샘플의 10 μL로 구성된 QC 샘플을 실행하여(정기적으로, 10–12개 샘플마다) 기기 성능을 모니터링합니다.
6. 역상 분리의 경우 C18 컬럼(2.1mm x 75mm, 3.5μm)을 사용합니다.
   1. 유속을 200μL/min으로 설정하고 자동 시료 주입기 및 컬럼 온도를 각각 4°C 및 55°C로 설정합니다. 하기 비율에 따라 이동상을 준비한다: 이동상 A:_H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM 암모늄 아세테이트 및 1 mM 아세트산; 이동상 B : IPA : MeOH (90 : 10, v / v), 10 mM 암모늄 아세테이트 및 1 mM 아세트산.
   2. 다음 매개변수에 따라 이동상 흐름을 설정합니다: 0–1분(20% B), 1–1.5분(20–50% B), 1.5–7.5분(50–70% B), 7.5–13분(70–95% B), 13–17분(95% B), 17–17.1분(95–20% B), 17.1–23분(20%).
7. HILIC 분리의 경우 HILIC 컬럼(100 x 2.1mm, 3μm)을 사용합니다.
   1. 유속을 400μL/min으로 설정하고 자동 시료 주입기 및 컬럼 온도를 각각 4°C 및 40°C로 설정합니다.
   2. 다음 비율에 따라 이동상을 준비합니다 : 이동상 A : ACN; 이동상 B : 물 중 5mM 암모늄 아세테이트. 다음 매개변수에 따라 이동상 흐름을 설정합니다: 0–2분(96% B), 2–15분(96–80% B), 15–15.1분(80–96% B), 15.1–21분(96% B).
8. 양이온화 모드에서 HESI 이온 소스 매개변수를 스프레이 전압 3,500V, 모세관 온도 275°C, 칼집 가스 20aU, 보조 가스 유량 10aU, 프로브 히터 온도 300°C, S-Lens RF 레벨 55%로 설정합니다.
9. 분석된 각 샘플의 10μL(10-12개 샘플마다)로 구성된 QC 샘플을 실행하여 기기 성능을 모니터링합니다.
10. 기기와 호환되는 소프트웨어에서 데이터 수집을 수행합니다.

6. 데이터 분석

1. 비표적 대사체학 및 지질체학 분석 전용 소프트웨어를 사용하여 데이터 처리, 추정 식별 및 통계 분석을 수행합니다.
   메모: 주성분 분석(PCA) 및 상자 수염 플롯을 얻어 데이터 구조를 시각화할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세트산	머 크	5330010050	이동상 첨가제
아세토니트릴	연금술	696-34967-4X2.5L	HPLC 용매
암모늄 아세테이트	머 크	5330040050	이동상 첨가제
BENCHMIXER XL 멀티 튜브 볼텍서	벤치마크 사이언티픽	BV1010	와류 믹서
모자	펄란 테크놀로지	5183-2076	블루 scrw tp, 프리 슬릿 PTFE / Si spta, 100PK
클로로포름	머 크	1024441000
Discovery HS F5 Supelguard 카트리지, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm	머 크	567570-유	HPLC 가드 컬럼
디스커버리 HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm	머 크	567502-유	HPLC 컬럼
포름산	연금술	497-94318-50ML	이동상 첨가제
유리병(glass vial)	펄란 테크놀로지	5182-0714
HILIC 루나 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm	심폴	PHX-00D-4449-B0	HPLC 컬럼
HILIC SecurityGuard 카트리지, 3 μm, 4 x 2.0 mm	심폴	PHX-AJ0-8328	HPLC 가드 컬럼
이소프로파놀	연금술	231-AL03262500	HPLC 용매
메탄올	연금술	696-34966-4X2.5L	HPLC 용매
나노 순수한 물	머 크	1037281002	HPLC 용매
Q Exactive Focus 하이브리드 사중극자-Orbitrap MS	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	Q 엑액티브 포커스	질량 분석기
SeQuant ZIC-cHILIC 3μm, 100Å 100 x 2.1 mm	머 크	1506570001	HPLC 컬럼
SeQuant ZIC-HILIC 가드 키트 20 x 2.1 mm	머 크	1504360001	HPLC 가드 컬럼
SPME LC 파이버 프로브, 혼합 모드	수펠코	프로토 타입 섬유
UltiMate 3000 HPLC 시스템	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	얼티메이트 3000	HPLC 시스템
바이알 인서트(비활성화)	펄란 테크놀로지	5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm	바다	186005644	HPLC 컬럼
XSelect CSH C18 VanGuard 카트리지 3.5μm, 2.1x5mm	바다	186007811	HPLC 가드 컬럼

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