세포외 DNA 염색: FFPE 조직 절편에서 세포외 DNA를 식별하는 방법

초록

출처: O'Sullivan, K. M. et al. 사구체신염에서 세포외 DNA의 반정량화를 위한 감독 기계 학습. J. Vis. 특급. (2020년)

이 비디오는 FFPE 조직 절편에서 세포외 DNA를 염색하는 기술에 대해 설명합니다. 염색된 세포외 DNA는 암세포를 사멸시키는 모든 치료 치료의 효능을 결정하기 위해 정량화할 수 있습니다.

프로토콜

1. DAPI 및 β-Actin을 사용한 ecDNA 염색

1. 유리 슬라이드를 60°C 오븐의 슬라이드 랙에 60분 동안 넣습니다.
2. 흄 후드에서 각각 40분 동안 두 번의 용매(자일렌 또는 대체물)를 교환하여 슬라이드를 담그십시오.
3. 슬라이드를 100% 에탄올, 100% 에탄올, 70% 에탄올로 각각 5분 동안 재수화합니다. 수돗물로 5분 동안 씻습니다.
4. 흄 후드에 핫플레이트를 놓고 압력솥에 항원 회수 용액(10mM Tris, 1mM EDTA pH 9.0)을 미리 끓입니다. 항원 회수 용액이 끓기 시작하자마자 집게를 사용하여 슬라이드를 냄비에 수평으로 놓고 뚜껑을 잠급니다. 고온(15psi 또는 103kPa에 해당)에서 10분 동안 끓입니다.
   메모: 이 단계는 항원 항원결정기(포르말린 고정을 통해 가교결합)를 해제하여 항원결정기 항체 특이적 결합을 허용함으로써 관심 항원을 검색하기 때문에 중요합니다. 후속 염색은 그것 없이는 작동하지 않습니다.
5. 압력솥을 불에서 내리고 싱크대의 뚜껑 위를 차가운 두드리기로 하여 즉시 뚜껑을 제거하세요. 항원 회수 용액에서 슬라이드를 20분 동안 평형을 이룹니다.
6. 오비탈 쉐이커에서 0.01M 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4)에서 5분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
7. 소수성 펜을 사용하여 신장 조직 주위에 원을 그리며 이 시간 동안 조직이 마르지 않도록 주의합니다.
8. 5% 소 혈청 알부민(BSA)/PBS(pH 7.4, 0.01M)의 10% 닭 혈청에서 30분 동안 섹션당 60μL의 조직을 차단합니다. 이 단계 후에는 세척하지 말고 60μL 피펫을 사용하여 차단 용액을 조심스럽게 제거하고 섹션이 건조되지 않도록 하십시오.
9. 1% BSA/PBS(pH 7.4, 0.01 M), 섹션당 60 μL에 1/1000으로 희석된 β-actin에 대한 기본 항체 칵테일을 적용하고 4 °C의 습도 챔버에서 밤새 배양합니다.
10. 오비탈 쉐이커에서 PBS(pH 7.4, 0.01M)로 5분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
11. 2 차 항체, 닭 반대로 토끼 488 (1/200), RT에 40 분 동안 1%BSA/PBS (PH 7.4, 0.01 M)에서 묽게 된 단면도 당 60 μL를 적용하십시오.
12. 오비탈 셰이커에서 PBS(pH 7.4, 0.01M)로 5분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
13. Coplin jar에 0.3% 에탄올에 70% 수단 블랙을 30분 동안 담가둡니다.
    메모: 이 단계는 포르말린 고정으로 인한 자가형광을 소멸시키기 때문에 중요합니다.
14. 침전물을 제거하기 위하여 수돗물에 있는 활주를 세척하고 그 후에 더 수단 까만 침전물이 형성되는 것을 막기 위하여 10 분 동안 PBS (PH 7.4, 0.01 M)에서 가라앉힌다.
15. DAPI가 포함된 60μL 장착 용액 3방울을 사용하여 컨포칼 유리 커버슬립에 슬라이드를 장착하고 커버슬립 둘레를 매니큐어로 밀봉합니다.
16. 슬라이드가 RT에서 24시간 동안 경화되도록(DAPI가 침투할 수 있도록) 그런 다음 빛으로부터 보호된 4°C에서 보관하십시오.
    메모: 형광 프로브의 퇴색을 방지하기 위해 어두운 곳에 보관하는 것이 중요합니다.
17. 현미경에 부착된 컨포칼 레이저 스캐닝 헤드를 사용하여 이미지를 슬라이드합니다. DAPI용 405 레이저와 Beta Actin용 488 레이저로 슬라이드를 자극하십시오. ecDNA를 검출하는 데 필수적인 라인 순차 캡처 및 4라인 평균화를 사용하여 단일 평면 1024 x 1024 픽셀 이미지를 캡처합니다. 40x 1.0 NA 오일 대물렌즈가 사용됩니다.
    1. 샘플당 최소 20개의 사구체를 이미지화합니다. 이미지를 ND2 파일로 저장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 세럼 알부민	시그마	A2153	5% 및 1% 용액은 PBS로 구성되며 대량으로 만들고 냉동할 수 있으며 해동되면 폐기할 수 있습니다
닭 안티 염소 IgG (H + L) 교차 흡수 항체 Alexa Fluor 594	써모피셔 사이언티픽	A-21468	항체 칵테일에 유리 접합체가 없는 것을 피하기 위해 사용하기 전에 1분 동안 미니 원심분리기를 돌립니다
닭 안티 마우스 IgG (H + L) 교차 흡수 항체, Alex Fluor 647	써모피셔 사이언티픽	A-121468	항체 칵테일에 유리 접합체가 없는 것을 피하기 위해 사용하기 전에 1분 동안 미니 원심분리기를 돌립니다
닭 안티 토끼 IgG (H + L) 교차 흡수 항체 Alexa Fluor 488	써모피셔 사이언티픽	A-21441	항체 칵테일에 유리 접합체가 없는 것을 피하기 위해 사용하기 전에 1분 동안 미니 원심분리기를 돌립니다
치킨 세라	시그마	C5405	1% BSA/PBS로 구성
커버슬립 24x60mm	아제르사이언티픽	ES0107222	#1.5 이것은 컨포칼 현미경 검사에 사용하도록 설계된 표준 두께가 아닙니다.
EDTA 10중	시그마	E6758	증류수에 TRIS와 EDTA를 함께 첨가하고 항원 회수를 위해 pH를 9로 추가하면 10x 용액으로 구성할 수 있습니다.
에탄올 30%, 70% 및 100%	화학 공급	유엔1170	100% 비변성 에탄올로 공급 - 증류수를 사용하여 30% 및 70%로 희석
포름알데히드, 4%(10% 중성 완충 포르말린)	트라잔	NBF-500	신장은 RT에서 16시간 동안 3ml의 포르말린이 들어있는 5ml 튜브에 넣고, 포르말린은 흄 후드에서 사용해야 합니다.
유리 조직학 슬라이드 - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm	트라잔	J3800AM4	양전하를 띤 코팅된 슬라이드를 사용하는 것이 필수적입니다. 항원 회수 단계에서 조직이 슬라이드에서 떨어져 나옴에 따라 슬라이드 코팅에 폴리-L-라이신을 사용하는 것은 권장하지 않습니다
염소 안티 human/mouse MPO 항체	R&D	AF3667	도착 시 영하 80도에서 부분 표본 및 동결
소수성 펜	벡터 랩스	H-400	신장 조직 주위에 원을 그리는 데 사용합니다
인산염 완충 식염수	시그마	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl은 한 번에 5L를 구성합니다.
압력솥 6L 테팔 시큐어 5 네오 스테인리스	테팔	GSA-P2530738	지역 가정 용품 매장에서 구입
골드 DAPI 연장	생명 기술	P36962	커버슬립에 직접 방울을 바르십시오.
토끼 anti human/mouse Beta Actin 항체	아캄	AB8227	도착 시 영하 80도에서 부분 표본 및 동결
토끼 anti human/mouse H3Cit 항체	아캄	AB5103	도착 시 영하 80도에서 부분 표본 및 동결
염색 랙, 슬라이드 24	프로사이텍	H4465	선택한 염색 랙은 압력에서 끓는 것과 60도 오븐에서 배양을 견딜 수 있어야 합니다
수단 블랙 B	시그마	199664	0.3 % 70 % 에탄올에 1L 병에 3g을 넣고 여과하여 빛으로부터 보호하십시오 - 실온에서 6 개월 동안 안정적
트리스 10mM	시그마	T4661	증류수에 TRIS와 EDTA를 함께 첨가하고 항원 회수를 위해 pH를 9로 10x 용액으로 구성할 수 있습니다.
크실렌	트라야누	XL005/20	흄 후드에 사용해야 합니다.