유도 만능 줄기 세포에서 인간 신장 Podocytes 도출: 줄기 세포에서 성숙한 Kidney Podocytes 의 지시된 분화를 위한 절차

초록

출처: Burt, M. et al. 화학적으로 정의된 조건에서 인간 유도 만능 줄기 세포에서 성숙한 신장 Podocytes 의 유도 분화. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오에서는 정의된 화학적 조건 하에서 세포 분화를 통해 유도 만능 줄기 세포에서 인간 신장 포도세포를 추출하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 생성된 포도사이트(podocytes)는 신독성 검사 및 질병 모델링에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 시약의 준비

1. hiPS 세포 배양 기저 배지에서 해동된 5x hiPS 세포 배양 배지(CCM) 보충제를 희석하여 hiPS CCM.
   의 1x 용액을 얻습니다. 메모: 냉동 5x hiPS CCM 보충제는 천천히 해동해야 하며, 이상적으로는 4°C에서 하룻밤 동안 해동해야 합니다. 1x hiPS CCM의 부분 표본은 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. hiPS 세포 배양을 위한 기저막(BM) 매트릭스 1 코팅 플레이트의 준비: BM 매트릭스 1을 4°C의 얼음에서 하룻밤 동안 해동합니다. 해동이 완료되면 제조업체에서 제안한 대로 적절한 희석 계수를 사용하여 부분 표본을 준비합니다.
   메모: 일반적으로 분취액은 50mL 원뿔형 튜브에 25mL의 차가운 DMEM/F12를 희석한 후 BM 매트릭스 1을 완전히 용해하고 잔류 결정의 형성을 방지하기 위해 철저하게 혼합하기 위해 준비됩니다.
3. BM 매트릭스 1 용액 1mL를 6웰 플레이트의 각 웰로 옮기고 파라핀 필름으로 싸서 37°C에서 1-2시간 동안 또는 4°C에서 최소 24시간 동안 배양합니다. BM 매트릭스 1 코팅 플레이트는 최대 2주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
4. 기저막(BM) 매트릭스 2 코팅 플레이트의 준비: 9mL 멸균 증류수에 적절한 양의 BM 매트릭스 2를 희석하여 5μg/mL의 최종 농도를 준비합니다. 12웰 플레이트의 각 웰에 700μL의 BM 매트릭스 2 용액을 추가하고 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
5. 다음과 같이 BMP7, Activin A 및 VEGF의 각각 100μg/mL 원액을 준비합니다: 0.1%(wt/vol) BSA를 함유한 멸균 증류수에서 BMP7을 재구성하고 0.1%(wt/vol) BSA를 함유한 멸균 PBS에서 Activin A 및 VEGF를 별도로 재구성합니다. 잦은 동결-해동 주기를 피하려면 각 원액에서 100μL 분취액을 준비하고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
6. Y27632 10mg을 3.079mL의 멸균 증류수에 용해시켜 Y27632 10mM 원액을 준비합니다. 재고에서 100 μL를 분취하고 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
7. 143.4μL의 멸균 DMSO에 CHIR99021 2mg을 용해시켜 30mM 원액을 준비합니다. 5μL 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다(또는 제조업체의 권장 사항에 따름).
8. 10mg의 all-trans 레티노산을 3.33mL 멸균 DMSO에 용해시킵니다. 500 μL 분취액을 준비하고 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.

2. 배양 배지의 준비

1. 해당 원액을 글루타민 보충제가 함유된 적절한 부피의 DMEM/12에서 100ng/mL Activin A, 3μM CHIR99021, 10μM Y27632 및 1x B27 무혈청 보충제의 최종 농도로 재구성하여 중배엽 분화 배지를 준비합니다.
   메모: 중배엽 분화 배지는 분화 단계 전에 실험 규모에 적합한 부피로 새로 준비해야 합니다(일반적으로 2개의 12-well 플레이트에 50mL의 배지가 적절함).
2. 해당 원액을 글루타민 보충제를 사용하여 DMEM/F12에서 100ng/mL BMP7, 3μM CHIR99021 및 1x B27 무혈청 보충제의 최종 농도로 재구성하여 중간 중배엽 분화 배지를 준비합니다.
   메모: 필요한 경우, 배지에 1%(vol/vol) 페니실린-스트렙토마이신을 보충할 수 있습니다. 글루타민 보충제와 함께 DMEM/F12를 사용하여 배지의 부피를 조정합니다. 이 매체는 대량으로 준비할 수 있습니다. 그러나 반복적인 동결-해동 주기를 피하기 위해 더 작은 부분 표본(예: 50mL 원뿔형 튜브의 경우 45mL)에 보관하는 것이 좋습니다. 이 매체는 -20°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있으며 사용하기 전에 밤새 4°C에서 해동할 수 있습니다.
3. 글루타민 보충제와 함께 DMEM/F12에서 100ng/mL BMP7, 100ng/mL activin A, 50ng/mL VEGF, 3μM CHIR99021, 1x B27 무혈청 보충제 및 0.1μM all-trans 레티노산을 최종 농도로 재구성하여 포도사이트 유도 배지를 준비합니다. 매체를 빛으로부터 보호하십시오(예: 용기를 호일 종이로 포장).
   메모: 이 배지는 대량으로 준비할 수 있으며 최대 3개월 동안 -20°C의 암간에 보관할 수 있습니다. 냉동 부분 표본은 사용하기 전에 4°C에서 밤새 해동해야 합니다.
4. DMEM/F12에 10%(vol/vol) 열 불활성화 FBS를 첨가하여 25mL의 트립신 중화 용액을 준비하고 멸균 조건에서 필터링합니다.
5. 줄기세포 유래 포도세포의 분화 후 유지를 위해 제조업체의 지침에 따라 기초 배지에 보충제를 첨가하여 포도사이트 유지 배지로 Complete Medium을 준비하고 최대 2주 동안 4°C에서 보관합니다.

3. hiPS 세포 배양 배지를 사용한 무급유 hiPS 세포 배양

1. 사전 코팅된 플레이트에서 BM 매트릭스 1의 잔류 용액을 흡입하고 1-2mL의 예열된 DMEM/F12로 웰을 3회 세척합니다.
2. 흡인은 hiPS 세포에서 hiPS CCM을 사용하고 가온된 DMEM/F12로 세포를 3회 헹굽니다. 따뜻한 세포 분리 용액 1mL를 추가하고 37°C에서 1분 동안 배양하면 세포 해리에 도움이 됩니다. 조직 배양 현미경으로 세포를 육안으로 검사하고 세포 군집의 가장자리가 둥글게 나타나는지 확인한 다음 세포에서 세포 분리 용액을 신속하게 흡인합니다(세포 군집이 느슨하기는 하지만 여전히 플레이트에 부착되어 있는지 확인). DMEM/F12로 세포를 한 번 부드럽게 헹구어 세포 분리 용액을 제거합니다.
3. 세포 분리 용액으로 처리된 hiPS 세포(6웰 플레이트의 각 웰에 있음)에 3mL의 hiPS CCM을 추가합니다. cell lifter를 사용하여 집락을 긁어내고, 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 느슨하게 부착된 세포를 제거합니다. 모든 세포가 수확되었는지 확인하기 위해 플레이트를 철저히 세척하십시오.
   메모: 세포의 과도한 전단을 방지하기 위해 5mL 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
4. 0.5mL의 세포 현탁액을 웰당 2mL의 hiPS CCM을 포함하는 새로운 BM 매트릭스 1 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 8자 모양으로 움직여 웰 내에 세포 군체를 분포시키고 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다. 세포가 계대배양이 준비되거나 분화 실험에 사용될 준비가 될 때까지(약 70% 포화도).
   메모: iPSC의 일상적인 전달을 위한 이상적인 콜로니 크기는 hiPS CCM(ROCK 억제제 제외)을 사용하여 피더가 없는 조건에서 200-500μm입니다. dissociation enzyme 또는 buffer로 처리하는 동안 세포가 개별화되면 hiPS CCM에 ROCK 억제제(예: 10μM Y27632)를 보충하여 세포 생존력을 향상시킬 수 있습니다.

4. hiPS 세포를 중배엽 세포로 분화(0-2일)

1. hiPS 세포 배양이 기하급수적 성장 단계(계대 배양 후 약 4일 이내, 약 70% 포화도)에 있는 동안 군집 내부 및 가장자리 주변에 자발적으로 분화된 세포의 존재 여부를 육안으로 검사합니다. 필요한 경우 무균 방식으로 차별화 영역을 긁어냅니다.
2. hiPS 세포에서 hiPS CCM을 흡인하고 따뜻한 DMEM/F12로 세포를 3회 헹굽니다. 1mL의 효소가 없는 세포 해리 완충액으로 세포를 37°C에서 10분 동안 배양하고 현미경으로 해리를 확인합니다. 서로 다른 hiPS 세포주 간의 고유한 차이로 인해 주어진 세포주에 대해 세포 해리 완충액의 실제 배양 시간을 결정해야 합니다.
3. 세포 리프터로 웰을 부드럽게 긁어 느슨하게 부착된 세포를 제거하고 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮긴 다음 위아래로 여러 번 피펫팅하여 hiPS 세포를 개별화합니다.
   1. 따뜻한 DMEM/F12를 사용하여 세포 현탁액을 15mL 용량으로 가져오고 실온에서 290 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
   2. 상등액을 부드럽게 흡인하고 따뜻한 DMEM/F12로 세포를 재현탁시켜 또 다른 원심분리를 진행하여 잔류 BM 매트릭스 1 및 해리 완충액 성분을 제거합니다.
4. 상등액을 흡인하고 상기한 바와 같이 1mL의 중배엽 유도 배지에서 세포를 재현탁합니다. 혈구계 또는 쿨터 계수기를 사용하여 총 세포 수를 계산하여 1 x 10⁵ cells/mL의 농도를 달성하는 데 필요한 중배엽 분화 배지의 적절한 부피를 결정합니다.
5. BM 매트릭스 2 코팅 플레이트에서 ECM 용액을 흡입하고 따뜻한 DMEM/F12로 플레이트를 두 번 헹굽니다. 몇 차례 피펫팅하여 hiPS 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 1mL의 세포 현탁액을 BM 매트릭스 2 코팅된 12웰 플레이트의 각 웰로 옮긴 다음 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 더 고르게 분포시킵니다.
6. 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 다음날 중배엽 유도 배지를 새로 고칩니다.
   메모: 2일 후, hiPS 세포 유래 중배엽 세포는 중간 중배엽 유도를 할 준비가 됩니다.

5. hiPS 세포 유래 중배엽 세포를 중간 중배엽으로 분화(2-16일)

1. 분화 프로토콜의 2일차에 중배엽 유도 배지를 흡인하고 웰 중간 중배엽 유도 배지당 1mL를 보충합니다.
2. 대사 활성 세포에 대한 성장 인자와 소분자의 정확한 임계값을 유지하기 위해 매일 배지를 새로 고칩니다. 상당한 세포 성장과 배지 영양소의 급격한 고갈이 있는 경우(배지의 황변으로 표시됨), 중간 중배엽 분화 배지의 부피를 12-웰 플레이트의 웰당 1.3mL로 증가시킬 수 있습니다.
3. 중간 중배엽 세포를 얻기 위해 추가로 14일 동안 세포를 배양합니다. 16일째가 되면 이러한 세포는 나중에 사용할 수 있도록 동결 보존할 수 있습니다.

6. hiPS 세포 유래 중간 중배엽 세포를 Podocytes로 분화(16-21일)

1. 중간 중배엽 세포를 따뜻한 DMEM/F12로 헹구고 37°C에서 3분 동안 0.05% 트립신-EDTA 웰당 0.5mL로 세포를 배양합니다.세포가 해리되기 시작하는지 육안 검사를 수행합니다.
2. 세포 리프터를 사용하여 세포를 긁어내고 1,000μL 피펫 팁을 사용하여 세포 현탁액을 여러 번 피펫팅하여 개별화된(또는 작은 덩어리) 세포를 얻습니다.
   메모: 이 단계에서는 응집된 세포가 프로토콜의 타임라인 내에서 말단적으로 분화된 표현형을 획득하지 못할 수 있으므로 세포가 완전히 해리되었는지 확인합니다.
3. 트립신의 활성을 멈추기 위해 트립신 중화 용액 웰당 약 2mL를 첨가합니다.
4. 세포를 50mL 코니컬 튜브로 옮기고 DMEM/F12를 사용하여 부피를 최대 50mL까지 가져온 다음 실온에서 201 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
5. 상층액을 흡인하고 podocyte 유도 배지에서 세포를 재현탁합니다. 최적의 결과를 얻으려면 12웰 플레이트의 약 100,000개 세포/웰의 최종 파스딩 밀도를 보장하십시오. 세포 현탁액을 BM 매트릭스 2 코팅 플레이트에 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포가 더 고르게 분포되도록 합니다.
6. 37 °C 및 5% CO₂에서 세포를 배양하고 최대 5일 동안 매일 배지를 새로 고쳐 21.
   일까지 포도세포를 얻습니다. 메모: 그 결과 생성된 hiPS 세포 유래 포도세포는 포도사이트 유지 배지와 함께 완전한 배지를 사용하여 추가로 2-4주 동안 배양에서 유지할 수 있습니다. podocyte 유지 배지에 들어가면 세포를 격일로 공급할 수 있으며 후속 연구 또는 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셀
DU11 인간 iPS 세포			DU11(Duke University clone #11) iPS 세포주는 Duke University iPSC Core Facility에서 생성되어 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 이 라인은 마이코플라스마에 대해 테스트되었으며 2019년 7월 우리 실험실에서 마지막으로 핵형 분석을 받았으며 핵형 정상으로 판명되었습니다.
성장 인자 및 미디어 보충제
올 트랜스 레티노산(500mg)	72262	줄기세포 기술
B27 무혈청 보충제	17504044	Thermo/Life 기술
CHIR99021	제04-0004	줄기 탐지기	로트별 변동이 나타날 수 있습니다
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DMEM/F12와 GlutaMAX 보충제	10565042	Thermo/Life 기술	DMEM/F12 및 글루타민 보충제
열 비활성화 FBS	10082147	Thermo/Life 기술
인간 활동 A	PHC9564	Thermo/Life 기술
인간 BMP7	PHC9544	Thermo/Life 기술
인간 VEGF	PHC9394	Thermo/Life 기술
mTeSR1 배지	제05850	줄기세포 기술	hiPS 세포 배양 배지(CCM)
페니실린-스트렙토마이신, 액상 (100×)	15140-163	Thermo/Life 기술
Y27632 ROCK 억제제	1254	토크리스
항 체
Alexa Fluor 488 및 Alexa Fluor 594 접합 2차 항체	A32744입니다. A32754입니다. A-11076; A32790	Thermo/Life 기술
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P20 배리어 피펫 팁	P1121	덴빌 사이언티픽
P200 배리어 피펫 팁	P1122	덴빌 사이언티픽
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혈청학적 피펫, 25 mL, 개별 포장	356525	코 닝
혈청학적 피펫, 5 mL, 개별 포장	356543	코 닝
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조직 배양 처리된 6웰 플레이트	353046	코 닝
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