유도 만능 줄기 세포에서 인간 신장 Podocytes 도출: 줄기 세포에서 성숙한 Kidney Podocytes 의 지시된 분화를 위한 절차

초록

출처: Burt, M. et al. 화학적으로 정의된 조건에서 인간 유도 만능 줄기 세포에서 성숙한 신장 Podocytes 의 유도 분화. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오에서는 정의된 화학적 조건 하에서 세포 분화를 통해 유도 만능 줄기 세포에서 인간 신장 포도세포를 추출하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 생성된 포도사이트(podocytes)는 신독성 검사 및 질병 모델링에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 시약의 준비

1. hiPS 세포 배양 기저 배지에서 해동된 5x hiPS 세포 배양 배지(CCM) 보충제를 희석하여 hiPS CCM.
   의 1x 용액을 얻습니다. 메모: 냉동 5x hiPS CCM 보충제는 천천히 해동해야 하며, 이상적으로는 4°C에서 하룻밤 동안 해동해야 합니다. 1x hiPS CCM의 부분 표본은 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. hiPS 세포 배양을 위한 기저막(BM) 매트릭스 1 코팅 플레이트의 준비: BM 매트릭스 1을 4°C의 얼음에서 하룻밤 동안 해동합니다. 해동이 완료되면 제조업체에서 제안한 대로 적절한 희석 계수를 사용하여 부분 표본을 준비합니다.
   메모: 일반적으로 분취액은 50mL 원뿔형 튜브에 25mL의 차가운 DMEM/F12를 희석한 후 BM 매트릭스 1을 완전히 용해하고 잔류 결정의 형성을 방지하기 위해 철저하게 혼합하기 위해 준비됩니다.
3. BM 매트릭스 1 용액 1mL를 6웰 플레이트의 각 웰로 옮기고 파라핀 필름으로 싸서 37°C에서 1-2시간 동안 또는 4°C에서 최소 24시간 동안 배양합니다. BM 매트릭스 1 코팅 플레이트는 최대 2주 동안 4°C에서 보관할....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셀
DU11 인간 iPS 세포			DU11(Duke University clone #11) iPS 세포주는 Duke University iPSC Core Facility에서 생성되어 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 이 라인은 마이코플라스마에 대해 테스트되었으며 2019년 7월 우리 실험실에서 마지막으로 핵형 분석을 받았으며 핵형 정상으로 판명되었습니다.
성장 인자 및 미디어 보충제
올 트랜스 레티노산(500mg)	72262	줄기세포 기술
B27 무혈청 보충제	17504044	Thermo/Life 기술
CHIR99021	제04-0004	줄기 탐지기	로트별 변동이 나타날 수 있습니다
포함 미디엄 키트 완료 컬처부스트-R	4Z0-500-R	세포 시스템	Podocyte 유지 관리 매체
DMEM/F12	12634028	Thermo/Life 기술
DMEM/F12와 GlutaMAX 보충제	10565042	Thermo/Life 기술	DMEM/F12 및 글루타민 보충제
열 비활성화 FBS	10082147	Thermo/Life 기술
인간 활동 A	PHC9564	Thermo/Life 기술
인간 BMP7	PHC9544	Thermo/Life 기술
인간 VEGF	PHC9394	Thermo/Life 기술
mTeSR1 배지	제05850	줄기세포 기술	hiPS 세포 배양 배지(CCM)
페니실린-스트렙토마이신, 액상 (100×)	15140-163	Thermo/Life 기술
Y27632 ROCK 억제제	1254	토크리스
항 체
Alexa Fluor 488 및 Alexa Fluor 594 접합 2차 항체	A32744입니다. A32754입니다. A-11076; A32790	Thermo/Life 기술
브라추리(T)	AB20680	아브캠
네프린	GP-N2	프로젠
10월4	AF1759	R&D 시스템
팍스2	71-6000	인비트로젠
무게1	MAB4234	밀리포어
ECM 분자
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) 단편	N-892012	Iwai North 아메리카	기저막(BM) 매트릭스 2
Matrigel hESC 인증 매트릭스, 5 mL 바이알	354277	BD 바이오사이언스	기저막(BM) 매트릭스 1. 로트별 변동이 나타날 수 있습니다
효소 및 기타 시약
아카쿠타아제	A1110501	Thermo/Life 기술	세포 분리 솔루션
증권 시세	A9418	시그마-알드리치
디메틸 설폭사이드(DMSO)	D2438	시그마-알드리치	DMSO는 독성이 있습니다. 화학 물질 안전 후드에서 취급해야 합니다.
효소가 없는 세포 해리 완충액, Hank's Balanced Salt	13150016	Thermo/Life 기술
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인산염 완충 식염수(PBS)	14190-250	Thermo/Life 기술
멸균 증류수	15230162	Thermo/Life 기술
트리톤 X-100	97062-208 (영어)	폭스바겐
트립신-EDTA, 0.05%	25300-120	Thermo/Life 기술
설비
흡입 피펫, 개별 포장	29442-462	코 닝
Avanti J-15R 원심분리기	B99516	벡크만 쿨터
원추형 원심분리기 튜브, 15 mL	352097	코 닝
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크라이오박스	3395465	Thermo/Life 기술	냉동 분취액 보관용
에보스 M7000	AMF7000	Thermo/Life 기술	고정 및 염색된 iPS 세포 및 그 유도체의 이미지를 획득하는 데 사용되는 형광 현미경
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P20 배리어 피펫 팁	P1121	덴빌 사이언티픽
P200 배리어 피펫 팁	P1122	덴빌 사이언티픽
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혈청학적 피펫, 25 mL, 개별 포장	356525	코 닝
혈청학적 피펫, 5 mL, 개별 포장	356543	코 닝
스테리플립, 0.22μm, PES	SCGP00525	EMD 밀리포어
멸균 마이크로 원심분리기 튜브	1138W14	토마스 사이언티픽	성장 인자 분취(aliquoting growth factor)를 위해
조직 배양 처리된 12웰 플레이트	353043	코 닝
조직 배양 처리된 6웰 플레이트	353046	코 닝
VWR 화이트 테크니 랩 코트	제10141-342	폭스바겐
넓은 베벨 셀 리프터	3008	코 닝

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