출처: Malysz, J. et al. 9-Phenanthrol-sensitive 양이온 전류의 특성화를 위한 갓 분리된 인간 배근 평활근 세포의 준비 및 활용. J. Vis. 특급 (2020년)
이 비디오에서는 2단계 순차적 효소 처리를 사용하여 인간 방광 표본에서 배뇨근 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Detrusor Smooth Muscle Cell Isolation: An Enzymatic Digestion Procedure to Obtain DSM Cells from Human Urinary Bladder Specimens(배뇨근 평활근 세포 분리: 인간 방광 표본에서 DSM 세포를 얻기 위한 효소 소화 절차)
2.9K 조회수
⸱
2023년 4월 30일
이 논문에서
초록
프로토콜
인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. DSM 조직 해부 및 점막이 없는 DSM 조각 준비
- 수술실에서 실험실에 도착한 전체 두께의 방광 표본을 냉간 해부/소화 용액으로 채워진 단단히 밀봉된 용기에 담아 검사합니다(DS 구성은 그림 1 및 표 1).
메모: 표본은 일반적으로 실험실에 도착하기 몇 시간부터 밤새도록 차가운 DS에 보관됩니다. 더 긴 보관을 위해 DS(표 1)에 1mM CaCl2가 보충됩니다. - 인체 전층 DSM 표본(점막, DSM, 혈청을 포함한 모든 층을 포함)을 얼음처럼 차가운 DS로 제거하고 헹궈 부착된 파편과 혈액을 씻어낸다.
- 점막이 위를 향하고 혈청이 아래를 향하도록 소변 방광 표본을 얼음처럼 차가운 DS로 채워진 직경 150mm의 실리콘 거울상 이성질체로 코팅된 (재료 표)에 고정합니다(그림 1B).
- 검체에서 인접한 지방 조직, 혈관, 상피(urothelium) 및 근육 점막을 마이크로 가위와 집게를 사용하여 날카로운 해부로 제거합니다.
- 점막이 없는 DSM 조각(길이 ~2–3mm, 너비 4–6mm) 여러 개를 잘라냅니다(그림 1C).
2. 새로 분리된 단일 DSM 세포를 생성하는 DSM 조각의 효소 해리
- 파파인과 디티오트레이톨(DS-P, 표 1)이 함유된 1-2mL의 예열된(~37°C) DS가 들어 있는 튜브에 3-6개의 DSM 조각을 넣고 DS-P에서 ~37°C에서 30-45분 동안 튜브를 가끔씩(10-15분에 한 번) 부드럽게 흔듭니다.
메모: 효소 처리를 위한 온도를 최적으로 제어하기 위해 조직 조각과 효소 용액이 있는 튜브를 순환 가열식 수조(그림 1D) 또는 고정밀 온도 제어 진탕수조(그림 1E)에 연결된 물로 채워진 유리 조직 챔버에 배치합니다. - 튜브에서 DS-P를 제거하고 얼음처럼 차가운 DS로 DSM 조각을 잠시 씻고 튜브에서 차가운 DS를 버리고 DSM 조각을 튜브 바닥에 둡니다.
- DSM 조각이 있는 튜브에 DS 함유 콜라겐분해효소 II(DS-C, 표 1) 1-2mL를 추가합니다. 부드럽게 섞어서 ~37°C에서 25-40분 동안 가끔씩(10-15분마다) 튜브를 부드럽게 흔듭니다.
- DS-C는 버리고 효소 처리된 DSM 조각을 얼음처럼 차가운 DS로 5-10회 세척합니다.
- 마지막 세척 후 DS 용액을 튜브 내부에 남겨두고 불에 닦인 파스퇴르 피펫으로 여러 번 부드럽게 분쇄하여 단일 DSM 세포를 방출합니다.
- 분산된 DSM 세포가 포함된 DS 용액 몇 방울을 유리 바닥 챔버 또는 커버슬립에 놓고 적용 후 최소 5분 후에 현미경(20x 또는 40x 대물렌즈 사용)으로 세포가 바닥에 부착되도록 하여 품질을 육안으로 검사합니다.
- 전기생리학 실험을 위해 갓 분리한 DSM 세포를 즉시 사용하거나 사용할 때까지 얼음 위 또는 냉장고에서 ~4°C의 DS가 들어 있는 튜브에 세포를 보관하십시오><(일반적으로 최대 8시간의 준비). 메모: 동일한 제제 내에서 세포의 품질은 생존력이 높은 세포부터 과도하게 소화되고 죽은 DSM 세포까지 다양합니다(그림 2). 순차적 파파인-콜라겐분해효소 방법으로 매우 많은 수의 생존 불가능한 세포가 생성되면 제제를 폐기하고 DSM 조각의 새로운 분해를 수행하지만 배양 간격을 줄입니다. 이 절차로 인해 DSM 세포가 너무 적어지면 DSM 조각의 후속 분해를 위해 배양 간격이 늘어납니다. α평활근 액틴에 대한 양성 면역반응은 DSM 세포의 정체를 확인합니다(그림 3).
| 솔루션 유형 | 구성(mM) |
| DS (Dissection/Digestion Solution, 해부/소화액) | 80 Na-글루타메이트, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 및 11 포도당, pH 7.4로 조정(10 M NaOH 포함) |
| DS-P(파파인 함유 DS) | 파파인 1-2 mg/ml, 디티오트레이톨 1 mg/ml 및 소 혈청 알부민 1 mg/ml를 함유한 DS |
| DS-C (콜라겐 분해 효소 함유 DS) | 1-2 mg/ml 콜라겐분해효소 II형, 1 mg/ml 소 혈청 알부민, 0 또는 1 mg/ml 트립신 억제제 및 100-200 μM Ca2+를 함유한 DS 용액 |
| P (피펫) | 110 CsOH, 110 아스파르트산, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.05 EGTA 및 30 CsCl, CsOH로 pH 7.2로 조정 및 암포테리신-B(300-500 μg/ml) 보충 |
| E (세포외) | 10 테트라에틸암모늄 클로라이드(TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 Hepes 및 10 포도당, NaOH 또는 CsOH 및 0.002-3 (2-3 mM) 니페디핀으로 pH 조정 |
표 1: 천공된 패치 클램프 실험에 사용된 해부/분해 용액(DS)과 피펫 및 세포 외 용액의 조성.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 1: 배뇨근 평활근(DSM) 조각의 준비로 이어지는 박리 단계 및 효소 해리에 사용되는 설정 요약. (A) 얼음처럼 차가운 DS에서 외부 수술 재료로 개복 방광 수술에서 제공된 전체 두께의 인간 방광 방광 표본, (B) 부분적으로 절개된 DSM 층으로 고정한 후 동일한 제제, (C) 효소 분해 준비가 된 DSM 층에서 잘라낸 다양한 치수의 DSM 조각(더 작은 조각) 또는 기타 실험 조사(더 큰 조각), (D, E) (1) 튜브를 통해 물로 채워진 대형 유리 조직 챔버에 연결된 온도 제어 순환 수조, 튜브용 고무 홀더, 해부/분해 용액(DS, DS-P 또는 DS-...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브 | 송골매 | 352054 | 분해 단계에 사용되는 효소를 함유한 DS용 튜브 |
| 아날로그 와류 믹서 | 폭스바겐 | 58816-121 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마-알드리치 | A7906 | 디에스에이치 |
| 염화칼슘 | 시그마-알드리치 | C1016 | 세포외 솔루션 및 DS |
| 에그타 | 시그마-알드리치 | E3889 | Ca2+ 킬레이터, 세포 내 피펫 용액에 사용 |
| 포도당 | 시그마 | G8270 | |
| 콜라겐분해효소 타입 2 | 워딩턴 생화학 공사 | LS004177 | DS-씨 |
| 수산화세슘 수화물 | 시그마-알드리치 | C8518 | Intracellular 피펫 솔루션 |
| 증권 시세 | 시그마-알드리치 | 203025 | Extracellular 및 intracellular 솔루션 |
| DL-디티오트레이톨(DDT) | 시그마-알드리치 | D9779 | 파파인과 병용하는 저감제 |
| 나오 | 시그마-알드리치 | S8045 | |
| 니페디핀 | 시그마-알드리치 | N7634 | L형 전압 의존성 Ca2+ 채널 차단기 |
| 플로팅 폼 튜브 랙/홀더 | VWR 사이언티픽 | 82017-634 | 온도 조절을 위해 효소가 있는 튜브를 고정하는 데 사용됩니다. |
| 글루타민산(Na 염) | 시그마-알드리치 | G1626 | 디에스에이치 |
| 파파인 | 워딩턴 생화학 공사 | LS003126 | DS-P |
| MgCl2 (육수화물) | 시그마-알드리치 | M2670 | Extracellular 및 intracellular 솔루션 |
| 케이클 | 피셔 사이언티픽 | BP366-1 | 세포외 솔루션 |
| 염화나트륨 | 시그마-알드리치 | S7653 | Extracellular 및 intracellular 솔루션 |
| 비금속 주사기 바늘, MicroFil | WPI (영어) | MF-34G-5 | 세포 내 피펫 용액 충진 |
| 파스퇴르 피펫 | 피셔브랜드 | 13-678-20ᅡ | 팁은 분해되고 파이어폴리싱되어 효소로 처리된 조직의 적정에 사용되어 조각에서 단일 DSM 세포를 방출합니다. |
| 헤페스 | 시그마-알드리치 | H3375 (영문 | pH 완충액 |
| Thermo Scientific 정밀 진탕수조(모델 2870) | 써모 사이언티픽(Thermo Scientific | 중단 | 효소 분해의 온도 조절을 위한 수조는 조직 챔버 순환 수조 설정의 대안으로 사용됩니다 |
| 비닐 튜브 | 콜파머 | 제06405-3 | 티슈 배스를 순환 수조에 연결하는 것을 포함한 다양한 용도 |
| 물 순환 수조, Haake D1 L | 하케 | 중단 | 티슈 배스에 연결 |
| ZeissAxiovert 40C 도립 현미경(10x 및 40x 대물렌즈 포함) | 칼자이스 | 중단 | patch-clamp 리그 설정의 일부 |
