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Amphotericin-B 매개 천공 패치 클램프 분석: 방광 세포의 이온 전류를 연구하기 위한 전기생리학적 기법

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Malysz, J. et al. 9-Phenanthrol-sensitive 양이온 전류의 특성화를 위한 갓 분리된 인간 배근 평활근 세포의 준비 및 활용. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 암포테리신-B 매개 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 배뇨근 평활근 세포의 일시적인 수용체 전위 멜라스타틴 유형 4(TRPM4) 이온 채널의 양이온 전류의 특성화를 보여줍니다. 이 기술은 이온 채널의 생물물리학적 및 약리학적 특성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Amphotericin-B Perforated Whole-cell Voltage Patch-Clamp 기술을 사용하여 DSM 셀에서 전압 단계 유도 양이온 전류 기록

  1. 0.25–1mL의 세포 현탁액을 도립 현미경의 스테이지에 있는 유리 바닥 챔버에 피펫팅하고 세포가 유리 바닥에 부착되도록 합니다.
  2. 최소 45분 동안 배양한 후 수조에서 소화 용액(DS)을 제거하고 흡입구 튜브를 통한 중력 보조 용액 흐름이 DS를 새 용액으로 천천히 교체하는 과융합에 의한 E 용액(표 1)으로 교체하고 진공 폐기물 용기에 연결된 배출 튜브는 챔버 용액을 제거하고 오버플로를 방지합니다.
    메모: E 용액에는 테트라에틸암모늄(TEA+) 및 세슘(Cs+) 이온이 포함되어 있어 K+ 전류를 억제합니다.
  3. 디메틸 설폭사이드(DMSO)(DMSO 10μL당 1mg)에 암포테리신-B의 작업 원료 용액을 준비합니다. 암포테리신 분말을 완전히 용해하려면 초음파 처리하고(최소 15분) 용액을 잘 와류에 넣습니다.
    메모: 이 단계는 일반적으로 10분 미만이 소요됩니다. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 30-40μL의 DSMO에 3-4mg의 암포테리신-B를 용해시키는 것이 좋습니다. 암포테리신-B의 양이 많을수록 일반적으로 더 많은 DSMO 용매가 필요하므로 혼합 간격이 길어지고 튜브에 존재하는 암포테리신-B 고체 입자의 불완전 가용화가 발생합니다.
  4. 피펫 용액(용액 P, 표 1)에 암포테리신-B의 원액을 용해시켜 200–500μg/mL의 최종 농도를 얻습니다. 이 단계에서는 피펫 용액에서 암포테리신-B 침전물 형성의 최적 혼합 및 방지를 보장하기 위해 단계당 ~30-60분 동안 고속 설정(8–10/10)에서 광범위한 초음파 처리 및 볼텍싱이 필요합니다.
    메모: 암포테리신-B는 시간이 지남에 따라 침전되며 빛에 민감합니다. Amphotericin-B를 함유한 작업 피펫 용액은 용해도를 확인하고 피펫 주입 전에 직접 혼합하고 어두운 곳에 보관합니다.
  5. 여러 개의 패치 전극, 파이어 폴리시 전극 팁을 당기고 (필요한 경우) 팁에 치과 왁스를 코팅합니다.
  6. 전극을 용액에 잠시 담궈 암포테리신-B가 없는 피펫 용액(용액 P, 표 1)으로 패치 전극의 끝을 채웁니다.
  7. 암포테리신-B가 포함된 동일한 피펫 용액으로 전극을 다시 채웁니다.
  8. 전극을 patch-cl에 연결된 홀더에 장착합니다.amp ampliifier 헤드stage.
  9. micromanipulator를 사용하여 전극의 끝이 잠기도록 세포외 용액의 표면 바로 아래에 전극을 놓습니다.
  10. 전압 클램프 모드에서 유지 전위를 0mV로 설정하고 상용 증폭기의 피펫 오프셋 다이얼을 사용하여 전류를 0pA로 조정합니다(재료 표).
  11. 상용 취득 소프트웨어의 Membrane Test window/function을 사용하여 전극 저항을 결정합니다(Table of Materials). 활성화하려면 Tools>Membrane Test>Play 또는 소프트웨어의 바로 가기 아이콘을 클릭하십시오. 결정된 전극 저항은 2 - 5 MΩ.
    범위여야 합니다. 메모: 상용 수집 소프트웨어 또는 증폭기의 씰 테스트 옵션에서 제공되는 멤브레인 테스트 기능을 사용하여 전압 단계를 반복적으로 적용하여 전극 저항을 모니터링할 수 있습니다.
  12. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 선택한 DSM 셀 쪽으로 전극을 전진시키면서 전극 저항을 계속 모니터링합니다(그림 1A).
    메모: 실행 가능한 DSM 세포로 간주되기 위해서는 세포가 방추 모양의 길쭉한 형태, 세포 주위의 잘 정의된 후광, 선명한 가장자리 및 반수축(구불구불한) 모양을 보여야 합니다.
  13. 전극으로 셀 표면을 만질 때(멤브레인 테스트 기능으로 측정된 전극 저항의 급격한 증가로 나타남) 튜브를 통해 전극 홀더에 부드럽고 빠른 음압을 가하여 기가씰을 형성합니다. 그 결과 세포막을 전극으로 끌어당기는 전극 끝에서 음압이 생성되어 기가 씰(giga-seal)이 형성되거나 전극과 원형질막이 매우 밀접하게 접촉하는 데 도움이 됩니다(그림 1B).
  14. 기가 씰이 형성되면 상용 증폭기의 고속 및 저속 다이얼을 조정하여 피펫 커패시턴스를 보상하고 멤브레인 테스트 기능을 사용하여 기가 씰의 안정성(누출 전류)을 모니터링합니다.
  15. 암포테리신-B가 피펫 아래로 확산되어 원형질막에 삽입되어 주로 1가 양이온에 대한 선택적인 기공을 형성할 때까지 일반적으로 30-60분의 시간을 허용합니다. 이 단계에서 멤브레인 테스트 기능을 사용하여 기가씰을 계속 모니터링합니다. 셀 천공이 증가함에 따라 멤브레인 테스트 기능으로 측정된 커패시턴스 과도 현상의 진폭(그림 1B와 그림 1C를 각각 유효 셀 천공이 없음을 나타냄)
    16. 도 증가합니다.
  16. 패치 천공이 최적이면(일반적으로 50MΩ 미만의 안정적인 직렬 저항으로 판단) 증폭기의 셀 커패시턴스 및 직렬 저항에 대한 다이얼을 조정하여 커패시턴스 과도 현상을 상쇄합니다. 이때 직렬 저항 보상도 수행할 수 있습니다(그림 1D).
  17. 지정된 프로토콜에 의해 유발된 안정적인 전압 단계 유도 양이온 전류가 관찰되면 화합물 또는 생리학적 조건을 적용하여 과융합으로 테스트하고 상용 수집 소프트웨어를 사용하여 제어, 테스트 조건 및 세척(가능한 경우)에 대한 응답을 기록합니다.
    1. DSM 셀을 -64 또는 -74 mV로 유지하고 -94에서 +96 또는 +106 mV로 400 또는 500 ms 동안 10 mV 단위로 전압을 스테핑한 다음 유지 전위로 돌아가는 것을 포함하는 일상적인 전압 단계 프로토콜로 전류를 기록합니다.
      메모: 멤브레인 전위 값은 14mV의 액체 접합 전위에 대해 조정됩니다(P 및 E 용액 사용, 표 1). 액체 접합 전위는 상용 수집 소프트웨어(Table of Materials)에서 Tools>Junction Potentials를 클릭하고 용액 이온 성분의 농도를 입력하여 얻습니다. 램프 프로토콜을 사용하여 현재 녹음을 가져올 수도 있습니다.
    2. 실험 중 연속 ~1분 간격으로 전압 프로토콜을 실행하여 사전 추가 제어, 테스트 조건 및 세척을 위한 전류를 기록합니다
      3. .
솔루션 유형구성(mM)
DS (Dissection/ Digestion Solution, 해부/소화액)80 Na-글루타메이트, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 및 11 포도당, pH 7.4로 조정(10 M NaOH 포함)
DS-P(파파인 함유 DS)파파인 1-2mg/ml, 디티오트레이톨 1mg/ml 및 소 혈청 알부민 1mg/ml를 함유한 DS
DS-C (콜라겐 분해 효소 함유 DS)1–2 mg/ml 콜라겐분해효소 II형, 1 mg/ml 소 혈청 알부민, 0 또는 1 mg/ml 트립신 억제제 및 100-200 μM Ca2+를 함유한 DS 용액
P (피펫)110 CsOH, 110 아스파르트산, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.05 EGTA 및 30 CsCl, CsOH로 pH 7.2로 조정 및 암포테리신-B(300-500 μg/ml) 보충
E (세포외)10 테트라에틸암모늄 클로라이드(TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES 및 10 포도당, NaOH 또는 CsOH 및 0.002–3(2–3 mM) 니페디핀으로 pH 7.3–7.4로 조정

표 1: 천공된 패치 클램프 실험에 사용된 해부/분해 용액(DS)과 피펫 및 세포 외 용액의 조성.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
그림 1: 인간 DSM 세포의 기가씰 형성 및 암포테리신-B 천공과 관련된 단계의 개략도. 피펫을 포함하는 암포테리신-B와 DSM 셀의 공간적 위치와 저항을 결정하는 전압 단계(이 예에서는 -10 또는 -20mV)를 변경하여 상용 수집 소프트웨어(Table of Materials)에서 얻은 멤브레인 테스트에 대한 관련 응답이 나와 있습니다. 구성은 다음과 같습니다: (A) 전극을 사용한 셀 접근 전, (B) 피펫이 포함된 암포테리신-B(빨간색 점으로 표시된 암포테리신-B)를 세포 표면에 배치하고 음압을 가하여 얻은 기가씰 형성 후, (C) 기가씰 형성 후 ~45분 후에 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브송골매352054분해 단계에 사용되는 효소를 함유한 DS용 튜브
암포테리신-B어부BP928-250패치/셀 천공에 사용
암포테리신-B유럽 약전 참조 표준물5패치/셀 천공에 사용
암포테리신-B시그마-알드리치A9528-100MG패치/셀 천공에 사용
아날로그 와류 믹서폭스바겐58816-121
아스파르트산시그마-알드리치A9006Intracellular 피펫 솔루션
소 혈청 알부민시그마-알드리치A7906디에스에이치
염화나트륨2시그마-알드리치C1016세포외 솔루션 및 DS
모세관 유리셔터재질 보기 BF150-110-7.5당겨진 패치 전극 준비를 위한 모세관
수산화세슘 수화물시그마-알드리치C8518Intracellular 피펫 솔루션
Clampex 버전 10 소프트웨어에는 데이터 수집(Clampex) 및 분석(Clampfit) 프로그램이 포함되어 있습니다Axon Instruments/ 분자 장치p클램프-10상용 소프트웨어 및 patch-clamp rig setup의 일부
증권 시세시그마-알드리치203025Extracellular 및 intracellular 솔루션
치과용 왁스Miltex 치과 왁스 기술, Inc.18058351
디메틸설폭사이드(DMSO)시그마-알드리치D2650용매
에그타시그마-알드리치E3889Ca2+ 킬레이터, 세포 내 피펫 용액에 사용
화염/갈색 마이크로피펫 풀러셔터P-97매우 미세한 팁으로 전극을 당기는 데 필요
플로팅 폼 튜브 랙/홀더VWR 사이언티픽82017-634온도 조절을 위해 효소가 있는 튜브를 고정하는 데 사용됩니다.
포도당시그마G8270
글루타민산(Na 염)시그마-알드리치G1626디에스에이치
헤페스시그마-알드리치H3375 (영문pH 완충액
케이클피셔 사이언티픽BP366-1세포외 솔루션
저소음 데이터 수집 시스템Axon Instruments/ 분자 장치디지데이터 1440Apatch-clamp 리그 설정의 일부
자석 교반기폭스바겐전화 01-442-684
MgCl2 (육수화물)시그마-알드리치M2670Extracellular 및 intracellular 솔루션
마이크로포지나리시게MF-830화재 연마 전극에 사용
염화나트륨시그마-알드리치S7653Extracellular 및 intracellular 솔루션
나오시그마-알드리치S8045
니페디핀시그마-알드리치N7634L형 전압 의존성 Ca2+ 채널 차단기
Nikon 도립 현미경, 5x, 10x, 20x 및 40x 대물렌즈가 있는 T1-SM 스테이지가 있는 TS100니콘중단패치 클램프 리그 설정의 일부
비금속 주사기 바늘, MicroFilWPI (영어)MF-34G-5세포 내 피펫 용액 충진
파스퇴르 피펫피셔브랜드13-678-20ᅡ팁은 분해되고 화염 연마되어 효소로 처리된 조직의 적정에 사용되어 조각에서 단일 DSM 세포를 방출합니다.
패치 클램프 증폭기Axon Instruments/ 분자 장치축삭 액소패치 200Bpatch-clamp 리그 설정의 일부
PC 컴퓨터작은 골짜기사용자 지정 구성patch-clamp 리그 설정의 일부
pH 측정기Aspera 기기PH700
폴리에틸렌 튜빙의료 서비스427-436유리 바닥 기록 챔버에 연결된 세포외 수조의 과융합을 위한 튜빙
테트라에틸암모늄 클로라이드시그마-알드리치T2265Kv 및 BK 채널의 이온 채널 차단제가 세포외 수조 용액에 추가되었습니다.
가중치 척도메틀러 톨레도XS64
ZeissAxiovert 40C 도립 현미경(10x 및 40x 대물렌즈 포함)칼자이스중단patch-clamp 리그 설정의 일부
개 . 표시기 년 ) 시리즈 년

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