사구체 분리: 쥐 신장에서 온전한 사구체를 얻는 기술

초록

출처: Eymael, J. et al. 두정상피 세포 활성화에 관여하는 경로를 분석하기 위한 생체 외 분석으로서의 사구체 성장. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 쥐의 신장에서 온전한 사구체를 분리하는 방법을 설명합니다. 이렇게 얻어진 캡슐화 및 캡슐화되지 않은 사구체는 쥐 신장에서 두정엽 상피 세포 파생물을 배양하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

참고: 처리되지 않은 건강한 야생형(WT) 마우스(n = 4) 및 cd44-/- (n = 4) 마우스는 12-16주령에 희생되었습니다. 수컷과 암컷 마우스를 모두 사용했습니다. 모든 마우스는 C57Bl/6 배경에 있었습니다.

1. 마우스 신장 박리

1. 건강한 WT 마우스 또는 유전적으로 변형된 마우스를 자궁 경부 탈구로 희생시킵니다.
2. 마우스를 희생한 직후 전체 마우스 신장을 절개합니다. 이를 위해 복부 가위를 사용하여 피부를 절단한 다음 복부 근육을 절단하여 정중 개복술을 수행합니다. 장을 제거하고 마우스 옆에 놓습니다.
3. 신장을 연결 조직에서 분리하고 수술용 집게를 사용하여 신장을 뽑아내고 가위로 신장 동맥, 신장 정맥 및 요관을 절단합니다.
4. 수술용 겸자로 신장을 잡고 신장에서 신낭을 제거하고 다른 겸자를 사용하여 캡슐을 당겨 빼냅니다.
5. 웰당 2mL의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)으로 준비된 6웰 세포 배양 플레이트(2개의 신장/웰)에 신장을 넣고 얼음 위에 놓습니다.

2. 마우스 신장에서 사구체 분리

1. 신장을 100mm 페트리 접시에 옮기고 두 개의 메스를 사용하여 신장을 1-2mm의 작은 조각으로 다집니다. 다진 신장 조각을 1-2mL의 HBSS를 사용하여 젖은 상태로 유지합니다.
2. 다진 신장 조각을 300μm 금속 체 위에 놓고 20mL 주사기의 플런저를 사용하여 체를 통해 신장을 누릅니다. 중간에 HBSS로 체를 반복적으로 헹구고 혈청학적 피펫을 사용하여 깨끗한 페트리 접시에 흐름을 수집합니다. 또한 메스로 긁어내어 체의 바닥에 남아 있거나 달라붙는 모든 것을 모으고 수집된 유동체(신장 균질산)로 옮깁니다.
3. HBSS로 75μm 체를 통해 신장 균질액을 헹굽니다. 유수를 수집한 후 53μm 체를 통해 이 유류를 헹굽니다. HBSS를 사용하여 두 체를 모두 세척하여 모든 작은 구조를 제거합니다.
   메모: 이 단계에서 플로우 스루는 헹궈내기만 하고 75 μm 및 53 μm 체를 통해 압착되지 않습니다. HBSS로 세척하면 체의 파편과 더 작은 구조물을 제거할 수 있습니다. 따라서 일반적으로 총 200-300mL의 HBSS가 사용됩니다.
4. 20% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)로 체의 상부 표면을 세척하여 75μm 및 53μm 체에 남아 있는 신장 구조/재료를 수집하고 재료를 6웰 초저 부착 마이크로플레이트로 옮깁니다.
   메모: 체의 윗면을 씻으려면 체를 기울어진 위치(>45°)로 헹구고 체 가장자리에 신장 물질을 모으십시오. 수집된 물질은 캡슐화 및 캡슐화된 사구체를 위해 농축되어 몇 개의 관형 단편만 보여줍니다. 캡슐화된 사구체는 매우 끈적합니다. 따라서 단일 사구체를 수집하려면 사구체가 페트리 접시 또는 웰 플레이트의 표면에 부착되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 접착을 방지하려면 FCS가 20%인 매체를 사용하고 이 단계에서는 초저 부착 플레이트를 사용하십시오.

3. 사구체 성장의 배양

1. 초저 부착 microplate를 도립 광 현미경으로 가져와 20 μL 피펫으로 단일 캡슐화 및/또는 캡슐화 해제된 사구체를 수집합니다. 다른 구조물 및 파편을 피펫팅하지 마십시오. 피펫 팁에 단일 사구체를 수집한 후, 수집된 신장 물질이 없는 새로운 DMEM 배지를 동일한 피펫 팁에 20μL 부피로 추가합니다.
2. 20 μL DMEM 배지가 있는 단일 사구체를 24-웰 세포 배양 플레이트의 웰 중앙으로 옮기고 37°C 및 5%(v/v) CO₂에서 3시간 동안 배양하여 사구체가 웰 중앙에 부착될 수 있도록 합니다. 사구체가 우물의 경계로 떠오르지 않도록 플레이트를 조심스럽게 움직입니다.
3. 3 시간 배양 후, 사구체는 우물의 중앙에 부착됩니다. 하이드로코르티손, 인간 내피 성장 인자, 소 뇌 추출물 및 겐타마이신 설페이트-암포테리신 B(재료 표)가 포함된 성장 인자 키트가 보충된 500μL의 내피 기저 배지(EBM)를 조심스럽게 추가하고 각 웰에 5%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep)을 추가합니다.
4. 단일 사구체를 37°C, 5%(v/v) CO₂.
   에서 6일 동안 배양합니다. 참고: 6일 이내에 두정상피세포(parietal epithelial cell)로 구성된 성장물이 형성됩니다. 두정엽 상피 세포에 대한 특정 화합물 또는 약물의 효과를 테스트하려는 경우 이 6일 이내에 배지에 추가해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 세포 배양 플레이트	코닝 코스타
디지털 도립광 현미경	Westburg, EVOS fl 현미경
Dulbecco's Modified Eagle's medium (둘베코의 변형 독수리의 매체)	론자
소 태아 세럼	론자
행크스의 균형 잡힌 소금 솔루션	지브코
페트리 접시	사르슈테트		사이즈 100
메스	달하우젠		사이즈 10
체	엔데콧 주식회사		크기: 300 μm, 75 μm, 53 μm, 스틸
초저 부착 마이크로플레이트	코닝 코스타		6웰 플레이트
주사기	BD 플라스티팍		크기: 20 mL