마우스 모델에서 정소성 방광 종양 모델링: 쥐 방광에 암세포의 방광 내 투여 절차

초록

출처: Tham, S. M. et al. 쥐 정소성 방광 종양 모델 및 종양 검출 시스템.J. Vis. 특급(2017년)

이 비디오에서는 암세포를 마우스 모델의 방광으로 전달하는 방광 내 절차에 대해 설명합니다. 이 절차는 치료 전략을 개발하는 데 사용할 수 있는 정형소 방광 종양 모델을 생성하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 종양 이식

참고: 각 마우스는 방광의 50μL의 DMEM blank media에 1 x 10 5MB49-PSA 세포를 이식합니다. 카테터의 데드 스페이스(dead space)로 인해 항상 여분의 부피를 준비하십시오(마우스당 최소 100μL 추가). 대안적인 접근 방식은 공기가 채워진 주사기를 사용하는 것입니다.

1. 셀
   1. 이식 하루 전, 세포가 약 80% 융합되면 37°C 및 5% CO₂에서 완전한 DMEM 배지(10% FBS, 2mmol/L L-글루타민, 0.05mg/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 200μg/mL Hygromycin B 보충)에서 MB49-PSA 종양 세포를 1:2의 분할 비율로 계대
   에 넣습니다.
   2. 시술 당일에는 멸균 세포 스크레이퍼로 부드럽게 긁어서 세포를 수확합니다. 동일한 부피의 세포 현탁액과 0.4% 트리판 블루 용액을 혼합합니다. 혈구계를 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다. 세포의 20% 이상이 죽은 경우 이식하지 마십시오.
   3. 필요한 살아있는 세포의 수(2 x 10,⁶ cells/mL)를 계산하고 이를 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 250 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다. DMEM 블랭크 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 이식하기 전에 FBS의 모든 흔적을 제거하기 위해 세척을 세 번 반복합니다.
   4. 생쥐가 이식할 준비가 될 때까지 세포 현탁액을 얼음 위에 두십시오.
2. 생후 4-6주 된 암컷 C57BL/6J 마우스가 시술 전 일주일 동안 순응할 수 있도록 합니다. 모든 동물 작업은 멸균 상태를 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
   1. 각 마우스의 무게를 측정하고 체중 10g당 0.1mL씩 마취제(75mg/kg 케타민 및 1mg/kg 메데토미딘)를 복강내로 주사합니다. 체중은 17g에서 22g 사이여야 합니다. 발가락을 꼬집은 후 반응이 없는 것을 관찰하여 마취를 확인합니다.
   2. 식별을 위해 귀 펀치를 사용하여 귀를 표시하십시오.
   3. 수분 공급을 위해 Hartmann 용액 또는 복합 젖산 나트륨을 체중 10g당 0.1mL씩 1-2시간마다 복강내에 주입합니다.
   4. 멸균 솜 전구를 사용하여 양쪽 눈에 멸균 안연 연고를 바르는데, 마취 시 깜박임 반사가 사라지고 눈이 건조해지기 때문입니다. 필요할 때 다시 바르십시오.
   5. 체온을 유지하기 위해 온찜질(공기와 접촉하여 활성화됨) 위에 종이 타월 위에 누운 자세로 생쥐를 눕히고 뒷다리를 테이프로 감습니다.
3. 손가락으로 하복부에 부드러운 압력을 가하고 방광에서 소변을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 수집합니다. 이 샘플은 요로 PSA의 기초 값으로 작용합니다.
4. 멸균 폴리-L-라이신(PLL)을 1mL 주사기에 넣고 바늘 탐침을 제거한 상태에서 24게이지 IV 카테터를 부착합니다. 카테터 끝에 윤활제를 바르고 집게를 사용하여 요도를 통해 카테터를 방광에 삽입하여 카테터 삽입을 안내합니다. 저항이 느껴지면 멈춥니다.
   참고: 연구자는 수의사와 방광 내 점안을 위한 마취제가 포함된 윤활 젤의 사용과 시술 후 진통제의 사용에 대해 논의해야 합니다.
5. 방광요관 역류를 피하기 위해 20초마다 10μL의 비율로 50μL의 PLL을 천천히 주입합니다. 카테터를 방광에 20분 동안 그대로 두어 마개를 사용하여 유출을 방지합니다.
6. 20분 후 카테터를 제거하고 하복부 부위를 부드럽게 눌러 방광에서 내용물을 비웁니다. 빈 1mL 주사기를 사용하여 카테터에 남아 있는 내용물을 모두 씻어냅니다.
7. MB49-PSA 세포를 피펫팅으로 철저히 혼합하고 1mL 주사기로 빼냅니다. 카테터를 부착하고 윤활제를 바릅니다. 50μL의 1 x 10⁵개 세포를 20초마다 10μL의 느린 속도로 주입합니다. 카테터의 마개를 교체하십시오. 대조군 마우스에게 50μL의 식염수를 제공합니다.
8. 1시간 후 카테터를 제거하고 방광에서 내용물을 비웁니다. 뒷다리의 테이프를 제거하고 쥐를 복부 쪽에 놓습니다. 역전제(1mg/kg 아티파메졸)를 체중 10g당 0.1mL로 피하주사하여 마우스를 소생시킵니다.
9. 운동성이 관찰될 때까지 마우스를 모니터링합니다. 쥐를 우리로 되돌립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MB49-PSA 셀			Ref (Wu QH, 2004년)
둘베코의 변형된 독수리 중간(DMEM) 미디어	바이오웨스트	L0102
소 태아 혈청(FBS) 남미	바이오웨스트	S1810
소 태아 혈청(FBS) 남미, 프리미엄	바이오웨스트	S181B
소 태아 세럼(FBS)	하이클론	SH30088.03
L-글루타민 Biowest X0550	바이오웨스트	X0550
페니실린-스트렙토마이신	바이오웨스트	L0022
하이그로마이신 B	인비트로젠	제10687-010
C57BL/6J 암컷 마우스	생체 내		4-6 주 이전
마취제(케타민 75mg/kg 및 메데토미딘 1mg/kg)	지역 약국
역전제(1mg/kg 아티파메졸)	지역 약국
귀 펀치	전자 현미경 과학	72893-01
Hartmann의 해결책 또는 합성 젖산 나트륨	B 브라운
안과 연고 - Duratears 무균 안구 윤활제 연고	알콘
히트 팩 - HotHands 손난로	히트맥스 Inc
Introcan Certo IV 카테터	B 브라운	제4251300	24G x 3/4인치
아쿠아젤 루브리케이팅 젤리	지역 약국
폴리 L- 라이신 용액, 0.01 %	시그마	P4707

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