마우스 방광의 요로텔륨으로 DNA 플라스미드 전달: 유전자 조작 모델을 생성하기 위해 DNA 플라스미드를 쥐 방광의 요로텔륨 세포로 효율적으로 전달하기 위한 전기천공 기반 절차

초록

출처: Chuan, Y. et al. 전기천공법에 의해 마우스 방광 요로상피에 플라스미드 DNA를 전달하는 새로운 방법. J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 요도 카테터 삽입과 전기천공법 기술의 조합을 사용하여 DNA 플라스미드를 마우스 방광의 요로 상피로 전달하는 방법을 보여줍니다. 설명된 절차를 통해 마우스 방광암 모델을 생성할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 플라스미드와 툴 준비

1. transfection할 각 방광에 대해 최소 20 μL의 DNA 플라스미드(1 μg/μL)를 준비합니다.
2. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 있는 20μL의 플라스미드 용액에 1μL의 Trypan Blue를 추가합니다. 잘 섞이는 피펫.
3. 모든 수술 기구를 오토클레이브하고 70% 에탄올로 작업 공간을 살균합니다. 수술 기구와 장갑에 70% 에탄올을 자주 뿌리거나 유리 구슬 살균기를 사용하여 다음 단계를 수행할 때 멸균 상태를 유지하십시오.

2. 플라스미드 전달

1. 마취된 마우스 복부에 에탄올 70%를 바르고 메스를 사용하여 1cm의 수직 절개를 만들어 방광 위의 복부 피부를 엽니다.
2. 최소 20μL의 플라스미드와 Trypan Blue 용액을 카테터 바깥쪽 끝에 피펫팅하고 주사기를 부착합니다.
3. 플라스미드 용액을 방광에 주입합니다. 방광이 파란색으로 변하면 주사가 성공한 것입니다. 방광에 기포가 생성되지 않도록 카테터에 약간의 액체를 남겨 두십시오.
4. 핀셋을 사용하여 외부 요도 구멍을 잡고 카테터와 주사기를 제거합니다. 끈을 사용하여 외부 요도 구멍을 조입니다. 끈으로 두 개의 루프를 만든 다음 두 개의 매듭으로 묶습니다.
   메모: 요도를 조이는 것은 플라스미드 액체의 역류를 방지하는 데 중요합니다.
5. 다음 매개변수를 사용하여 electroporation generator를 켭니다: 33V, 50ms 작업 시간 및 950ms 간격 시간.
6. 핀셋으로 방광을 잡고 두 개의 전극으로 방광을 꼬집습니다. 풋 페달을 밟아 electroporation.
   메모: 전기 펄스는 각 페달을 밟은 후 짧은 간격으로 5번 발생하도록 설정됩니다. 이 과정에서 마우스가 경련할 수 있습니다. 풋 페달을 두 번 이상 밟으면 전달 효율이 높아질 수 있지만 전기 펄스가 너무 많으면 요로상피의 조직 무결성이 손상될 수 있습니다.
   1. 핀셋과 전극 사이에 스파크가 발생할 수 있으므로 접촉을 피하십시오.

3. 회복

1. 멸균 수술용 봉합사와 클립으로 복부와 피부 입구를 봉합합니다. 상처에 요오드를 바르십시오.
2. 이소플루란 시스템에서 동물을 제거합니다. 수술 후 통증을 완화하기 위해 부프레노르핀 진통제(0.1mg/kg)를 피하로 투여합니다.
3. 동물을 발열 패드에 보관하고 완전히 회복된 후 가정용 케이지로 되돌려 놓습니다. 절개 부위가 치유될 때까지 적어도 하루에 한 번 동물의 정상적인 움직임, 음주 및 섭식 행동과 감염 징후가 없는지 확인한 다음 클립을 제거합니다. 동물이 그루밍 감소, 공격성 증가 및 발성과 같은 통증 증상을 보이는 경우 부프레노르핀 진통제를 후속 주사합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD 1mL TB 주사기	어부	148232E
부프레노르핀	시그마	B9275-50MG
Dumont 핀셋	Roboz 외과 Instr	RS-5005	수술 전에 70% 에탄올로 치료하십시오.
ECM830 SQ Wave 전기천공기	하버드 기구	450052
Exel International 일회용 Safelet I.V. 카테터	피셔 사이언티픽	Tel.: 14-841-21	24G, 길이 2.11cm, 외경 0.045cm
초극세 마이크로 해부 가위	Roboz 외과 Instr	RS-5135	수술 전에 70% 에탄올로 치료하십시오.
이소플루란	수의사 1명	501017
K&H 소형 동물을 위한 히팅 레스트 매트, 9 x 12 인치	아마존		히트 매트를 종이 타월로 덮으십시오
안과 연고	어부	NC0849514
PBS, pH 7.4	생명 기술	10010049
피펫 팁 200 μL	미국 과학	제1111-0206
피펫 팁, 범용 핏; 0.1 - 10 μL	어부	02707438(CS)
피펫맨 네오 P2	길슨	F144561
피펫맨 네오 P200N	길슨	F144565
플라스미드 CAG-GFP	애드진	16664
플래티넘 핀셋 5mm	하버드 기구	450489	직경 5mm
가위	Roboz 외과 Instr	RS-5880	수술 전에 70% 에탄올로 치료하십시오.
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