엑소좀 분리: 배양된 세포의 컨디셔닝된 배지에서 엑소좀을 분리하기 위해 설탕 쿠션을 사용하는 밀도 기반 초원심분리 기법

초록

출처: Faruqu, F. N. et al. 암세포로의 siRNA 전달을 위한 엑소좀의 준비.J. Vis. 특급 (2018)

이 동영상은 중수소산화물에서 제조된 25%(w/w) 자당 쿠션을 사용하여 인간 배아 신장 세포 배양에서 수확한 컨디셔닝 배지에서 엑소좀을 분리하는 밀도 기반 초원심분리 기술을 설명합니다. 분리된 엑소좀은 다운스트림 응용에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 자당 쿠션에 엑소좀 분리

1. 다음과 같이 차등 원심분리 및 여과를 통해 수확된 컨디셔닝된 배지(CM)를 미리 세척합니다.
   1. 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기.상등액을 새 튜브에 옮기고 펠릿을 버립니다. 이 원심분리 단계를 한 번 더 반복하여 상층액을 회수하고 펠릿을 버립니다.
   2. 1.1 단계의 상등액을 2,000 x g에서 15 분 및 4 ° C 동안 원심 분리 한 다음 펠릿을 폐기합니다. 0.22μm 필터를 통해 회수된 상층액을 한 번 여과합니다.
2. 사전 세척하는 동안 범용 튜브에서 1.9g(± 0.001g)의 자당을 정확하게 칭량한 다음 무게가 7.6g(± 0.001g)에 도달할 때까지 중수소산화물을 보충하여 중수소산화물에 25%(w/w) 자당 용액을 준비합니다.
3. 초원심분리 튜브(재료 표 참조)에 22.5mL의 사전 세척된 CM을 채웁니다. 현재 부피가 그보다 작은 경우 0.22μm 여과된 PBS로 CM을 22.5mL로 구성합니다.
4. 튜브에 유리 피펫 (재료 표 참조)을 놓고 이를 통해 3mL의 자당 용액을 첨가하여 용액이 CM 아래에 별도의 층을 형성하도록 합니다.
5. 층이 있는 CM/자당 용액이 들어 있는 튜브를 스윙 아웃 로터의 버킷에 조심스럽게 넣고(재료 표 참조) 버킷을 로터에 고정합니다.
6. 로터를 초원심분리기에 넣고(재료 표 참조) 100,000°C에서 1.5시간 동안 4 x g로 회전합니다.
7. 2mL의 자당 층을 수집하고 이를 세척 단계를 위해 20mL의 여과된 PBS가 들어 있는 초원심분리기 병(재료 표 참조)에 추가합니다.
8. 튜브를 고정각 로터에 넣고(재료 표 참조) 100,000 x g로 4°C에서 1.5시간 동안 회전합니다.
9. 10mL 혈청학적 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 여과된 400μL PBS로 펠릿을 재현탁합니다. 이 엑소좀 재고는 단기 및 장기 보관을 위해 각각 4°C 또는 -80°C로 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자당	피셔 사이언티픽	S/8600/60	1의 kg
중수소산화물(D2O)	시그마-알드리치	151882	250 지
1X 인산염 완충 식염수	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10010015	500 밀리리터
Millex-GP 주사기 필터 장치 0.22 μm	밀리포어	SLGP033RS
초원심분리기	벡크만 쿨터	옵티마 XPN-80
스윙 아웃 로터	벡크만 쿨터	SW45 티
고정각 로터	벡크만 쿨터	타입 70 Ti
초원심분리기 튜브	벡크만 쿨터	355631	폴리카보네이트. 최대 채우기 32ml
초원심분리기 병	벡크만 쿨터	355618	폴리카보네이트. 최소 충전 16ml, 최대 충전 25ml
원심 분리기	에펜도르프	5810R
유리 피펫	피셔 사이언티픽	1156-6963
25% w/w 자당 쿠션			범용 튜브에 자당 1.9g(± 0.001g)을 넣고 무게가 7.6g(± 0.001g)에 도달할 때까지 D2O를 채웁니다. 이것은 25% w/w 자당 쿠션의 ~6ml를 만듭니다.