쥐 신장 세포 분리: 신장 세뇨관 상피 세포의 1차 배양을 분리하고 생성하는 기술

초록

출처: Ding, W. et al. 마우스 1차 신관 상피 세포의 분리, 특성화 및 고처리량 세포 외 플럭스 분석. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 광범위한 분자 생물학 및 세포 배양 연구를 위해 신장 세뇨관 상피 세포를 분리하고 정제하는 단계를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 조직 처리 및 1차 세뇨관 세포 분리

1. 신낭과 수질을 제거하고 양쪽 신장을 작은 조각으로 다진 다음 37°C 오븐에서 5분 동안 부드럽게 회전하면서 10mL의 소화 완충액으로 배양합니다.
2. 70μm 필터를 통해 완충액을 통과시켜 소화되지 않은 신장 조직을 제거합니다. 배양 배지 10mL를 추가하여 분해를 중지합니다.
3. 세뇨관 세포를 수집하기 위해 여과된 세포 현탁액을 50 x g에서 5분 동안 원심분리하여 첫 번째 펠릿을 수집합니다. 상층액을 새 튜브로 옮기고 5mL의 배양 배지를 추가하고 50 x g에서 5분 동안 원심분리하여 모든 세뇨관 세포가 두 번째 펠릿에 모이도록 합니다. 원심분리는 주로 무거운 세뇨관을 펠릿으로 가공하기 위해 더 낮은 속도입니다. 나중에, 세포가 분리에서 회복된 후, 순수한 관형 배양물은 하위 배양 중에 더 빠른 속도로 원심분리됩니다.
4. 첫 번째 펠릿을 20mL의 배양 배지에 재현탁시키고 50 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세 번째 펠릿을 수집합니다.
5. 두 번째 및 세 번째 펠릿을 1mL의 배양 배지에 재현탁합니다. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 Trypan Blue를 혼합하고, 혼합물을 계수 슬라이드의 챔버 A에 로드하고, 자동 세포 카운터에서 세포 생존율을 기록합니다.
6. 콜라겐이 미리 코팅된 단일 60mm 접시에 최대 10개의⁷ 세포(이종 집단)를 파종하고 하룻밤 동안 세뇨관 세포를 부착합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐 I 쥐 단백질, 꼬리	써모피셔 사이언티픽	A1048301
콜라겐분해효소 II형	워 딩 턴	LS004176
신장 상피 세포 성장 배지 2 키트	프로모셀	C-26130
TC10 자동 셀 카운터	바이오 라드	506BR2119