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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 조직 처리 및 1차 세뇨관 세포 분리
- 신낭과 수질을 제거하고 양쪽 신장을 작은 조각으로 다진 다음 37°C 오븐에서 5분 동안 부드럽게 회전하면서 10mL의 소화 완충액으로 배양합니다.
- 70μm 필터를 통해 완충액을 통과시켜 소화되지 않은 신장 조직을 제거합니다. 배양 배지 10mL를 추가하여 분해를 중지합니다.
- 세뇨관 세포를 수집하기 위해 여과된 세포 현탁액을 50 x g에서 5분 동안 원심분리하여 첫 번째 펠릿을 수집합니다. 상층액을 새 튜브로 옮기고 5mL의 배양 배지를 추가하고 50 x g에서 5분 동안 원심분리하여 모든 세뇨관 세포가 두 번째 펠릿에 모이도록 합니다. 원심분리는 주로 무거운 세뇨관을 펠릿으로 가공하기 위해 더 낮은 속도입니다. 나중에, 세포가 분리에서 회복된 후, 순수한 관형 배양물은 하위 배양 중에 더 빠른 속도로 원심분리됩니다.
- 첫 번째 펠릿을 20mL의 배양 배지에 재현탁시키고 50 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세 번째 펠릿을 수집합니다.
- 두 번째 및 세 번째 펠릿을 1mL의 배양 배지에 재현탁합니다. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 Trypan Blue를 혼합하고, 혼합물을 계수 슬라이드의 챔버 A에 로드하고, 자동 세포 카운터에서 세포 생존율을 기록합니다.
- 콜라겐이 미리 코팅된 단일 60mm 접시에 최대 10개의7 세포(이종 집단)를 파종하고 하룻밤 동안 세뇨관 세포를 부착합니다.