유체역학적 신장 골반 주사: 쥐 모델의 신장 세포에 DNA를 직접 전달하는 기술

초록

출처: Woodard, L. E. et al. 신장 내 단백질의 비바이러스 발현을 위한 유체역학적 신장 골반 주사. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 핵산 transfection을 위해 마우스 신장의 신장 골반에 플라스미드를 유체역학적으로 주입하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 조직 손상을 일으키지 않고 플라스미드를 특정 부위로 강제로 구동하는 높은 정수압의 원리를 활용하여 플라스미드의 장기 특이적 전달을 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 유체역학적 신장 골반 주사 수술 수행

1. 수술을 위해 마우스를 신중하게 선택하십시오.
   참고: 변형주별 차이는 아직 관찰되지 않았지만 가능할 수 있습니다. 대부분의 주사는 C57BL/6 또는 FVB 배경에서 이루어졌습니다. 신장 골반 주사는 생후 6-12주 된 생쥐에서 가장 효과적입니다. 16주 이상의 마우스에서는 불분명한 이유로 루시퍼라제 이미징에 의한 최대 50%의 실패율이 가능합니다. 간에 대한 유체역학적 꼬리 정맥 주사에 대해서도 동일한 연령 관련 실패율이 관찰되었으므로 이는 유체역학 주입의 원리와 관련된 일반적인 제한 사항일 수 있습니다. 같은 맥락에서, 다른 사람들은 섬유성 쥐 간에 유체역학적 꼬리 정맥 주입이 건강한 간만큼 효과적이지 않다는 것을 보여주었으므로 신장 섬유증 환경에서 신장 골반 유체역학 주입이 효과적이지 않을 수 있지만 직접 테스트되지는 않았습니다.

2. 수술을 위한 마우스와 DNA 주사기 준비

1. 케타민과 자일라진으로 생쥐를 마취합니다.
   1. 일회용 실험실 앞치마, 수술용 안면 마스크, 니트릴 장갑과 같이 동물 시설에서 요구하는 올바른 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   2. 한 번에 2-4마리의 마우스로 작업하면서 500mL 플라스틱 비커에 담긴 각 마우스의 무게를 0.1g까지 정확하게 측정합니다. 복강내 주사로 각 마우스에 투여하기 위해 일반 0.9% 식염수에 희석된 24mg/mL 케타민과 2mg/mL 자일라진의 정확한 양을 계산합니다(복강내 주사에 대한 자세한 내용은 참조된 비디오 참조). (50 μL + ((5 μL) x (weight(g))) 공식을 사용하거나 현지 수의사 팀 및 IACUC와 상담 한 후 다른 공식에 따라 계산하십시오.
   3. 표준 기술에 의한 복강내 주사로 마우스를 주입합니다. 마우스가 움직이지 않을 때까지 종이 통에 마우스를 넣습니다.
      참고: 생쥐는 발가락 꼬집음 테스트에 더 이상 반응하지 않을 때 수술할 준비가 된 것입니다. 초기 주입 후 20-30분 후에 발가락 꼬집음 테스트에 계속 반응하는 마우스에게 반응의 강도에 따라 20-60μL 더 많은 마취제를 투여합니다.
   4. 파란색 패드로 덮인 물 순환 열 패드에 마우스를 놓고 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 수의사 연고를 바르십시오.
2. 애완동물 미용을 위해 설계된 면도기로 마우스 뒤쪽의 왼쪽을 어깨에서 엉덩이, 옆구리에서 척추까지 면도합니다. 느슨한 머리카락과 부스러기를 제거하십시오.
3. 마취된 각 마우스에 대해 100μL의 희석된 DNA가 포함된 별도의 주사기를 준비하고 기포가 없는지 확인합니다.
   1. 안전 장치 없이 영구적으로 부착된 바늘이 있는 멸균 29G x 1/2" 0.5mL U-100 인슐린 주사기를 사용하십시오.
      참고: 주사기 유형은 매우 중요합니다. 이 게이지는 빠른 주입을 가능하게 합니다. 영구적으로 부착된 바늘은 용액이 누출되는 것을 방지합니다. 안전장치가 있으면 신장 골반에 접근하는 것을 방해할 수 있습니다. 재료 표에 명시된 주사기는 테스트된 다른 브랜드보다 주입 중에 더 균일하게 미끄러집니다.
   2. 주사기를 ~120μL로 로드하고 플런저를 아래로 당겨 상단에 공간을 만듭니다. 모든 기포가 위로 올라올 때까지 펜으로 두드립니다. 바늘을 위로 잡고 플런저를 조심스럽게 눌러 바늘 끝에 물방울이 형성될 때까지 모든 공기를 제거합니다. 눈에 보이는 거품이 없어야 하며, 이는 동물을 죽일 수 있는 공기 색전증을 유발할 수 있습니다.
   3. 여분의 DNA 용액을 원래 마이크로fuge 튜브에 비워 주사기에 100μL가 될 때까지 플런저를 누릅니다. 필요한 경우 조심스럽게 라벨을 붙이고 장전된 주사기를 멸균 드레이프에 올려 놓아 작업이 수행되는 시설에서 바늘 재포장을 허용하지 않는 경우 멸균 상태를 유지합니다.

3. 주사 수술

1. 수술 부위를 준비합니다. 열 패드 위에 멸균 드레이프를 놓고 멸균 드레이프 위에 멸균 수술 도구를 건드리지 않고 비우십시오. 마우스를 들어 시야에 놓습니다. 조명을 조정하여 영역을 비춥니다.
2. 포장에서 3.15% 클로르헥시딘 글루코네이트와 70% 이소프로필 알코올 피부 소독용 면봉 3개를 꺼내 동물 근처에 두십시오.
3. 멸균 수술용 장갑으로 갈아끼세요. 절개 부위에서 시작하여 원을 그리며 작업하면서 새로운 클로르헥시딘/알코올 면봉으로 동물을 세 번 면봉으로 닦습니다.
4. 그림 1A와 같이 절개 부위를 찾습니다. 핀셋으로 피부를 꼬집고 가위를 사용하여 척추에서 약 1cm, 흉곽 아래 피부층을 자릅니다. 절단 부위의 길이가 약 1cm가 되면 아래의 근육층에서 유사한 절단 부위를 만듭니다.
   참고: 절개 부위를 신장이 간신히 통과할 수 있도록 절개 부위를 적절한 길이로 만든 다음 절개 부위 자체에 의해 제자리에 고정됩니다. 절개 부위가 너무 작으면 신장이 노출될 수 없습니다. 너무 크면 신장이 계속해서 복강으로 다시 미끄러져 들어갈 것입니다.
5. 신장을 찾습니다.
   메모: 백색 지방 조직에서 볼 수 있습니다. 비장은 또한 동물의 왼쪽에 있습니다. 이러한 기관의 색상은 비장은 짙은 적갈색이고 신장은 짙은 빨간색-주황색이기 때문에 시각적으로 구별할 수 있습니다. 비장은 쉽게 파열될 수 있으므로 조작하는 것은 바람직하지 않습니다.
6. 신장을 건드리지 말고 손가락으로 복부를 꾸준하고 부드럽게 눌러 신장을 복강에서 부드럽게 노출시킵니다(그림 2C). 필요한 경우 닫힌 핀셋을 사용하여 원하지 않는 장기를 복부로 부드럽게 밀어 넣습니다. 열린 집게는 신장이나 다른 장기를 손상시킬 수 있으므로 사용하지 마십시오.
7. 신장이 복부에서 나오면 신장 골반이 보일 정도로 작은 흰색 점이 보일 정도로 주변 지방과 부드럽게 분리합니다(그림 1B). 여분의 지방을 한쪽으로 밀거나 필요한 경우 제거하십시오. 신장의 위쪽 극 근처에 있는 부신이나 신낭을 제거하지 마십시오.
8. 닫힌 집게를 사용하여 신장 골반이 보이도록 신장의 오른쪽을 아래로 누르고, 장전된 인슐린 주사기를 오른손으로 잡고 바늘이 신장 골반을 가리키도록 작업 표면과 평행하게 유지합니다(그림 2E). 그림 1B와 같이 고정된 신장의 신장 골반에 바늘을 조심스럽게 삽입합니다.
9. 3초 이내에 용액을 빠르게 주입합니다. 신장의 약 1/3이 맑아지고 색이 흰색으로 변할 수 있습니다.
   참고: 주사 후 신장 캡슐에 체액이 축적되고 혈종이 형성되는 것을 관찰하는 것은 일반적입니다. 검출을 위한 충분한 수준의 DNA transfection을 달성하기 위해서는 약간의 손상이 필요합니다.
10. 용액의 역류를 방지하기 위해 바늘을 약 10초 동안 제자리에 두십시오. 그런 다음 조심스럽게 천천히 바늘을 제거하십시오. 절개 부위를 부드럽게 펴고 닫힌 집게를 사용하여 장기를 복강으로 되돌립니다.
11. 5-0 흡수성 봉합사로 동물의 근육층을 봉합하고 2-4 개의 독립적 인 매듭을 놓습니다.
12. 5-0 또는 6-0 비흡수성 나일론 봉합사로 동물의 피부층을 봉합하고 2-4개의 독립적인 매듭을 짓습니다.
    참고: 수술 도구는 멸균 비드 수조에 넣고 식힌 후 재사용할 수 있습니다.

결과

그림 1. 유체역학적 신장 골반 주사를 위한 올바른 절개 부위와 바늘 배치. A) 절개 부위(빨간색 선)는 척추에서 약 1cm, 마우스의 흉곽 아래 약 1cm에 위치해야 합니다. B) 옆구리 절개를 통해 신장을 노출시킨 후, 신장 골반은 신장 중간에 황색을 띤 작은 투명/흰색 점으로 위치해야 합니다. 주사는 신장 정맥, 신장 동맥 또는 요관을 방해해서는 안 됩니다. 인슐린 주사기의 바늘은 약 0.5cm 깊이로 신장 골반에 직접 삽입되고 2-3초 안에 빠르게 눌립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아나세드 자일라진	패터슨 수의학	07-808-1947	마취제 - 통제되지 않는 물질
BD 인슐린 주사기 0.5 mL 29G 1/2 인치	카디널 헬스(Cardinal Health)	309306	필요한 주사기
부프레넥스	약사/수의사		진통제 - 규제 약물
초극세 마이크로 해부 가위	Roboz 수술 기구	RS-5882	수술 도구
Gaymar 히트 펌프	파라곤 메디컬	티피-700	물 순환 히트 펌프
저미네이터 500	Roboz 수술 기구	재질 보기 DS-401	수술 중 수술 도구를 재사용하려면
그레이프 집게	Roboz 수술 기구	RS-5136	수술 도구
Graefe 조직 겸자	Roboz 수술 기구	RS-5153	수술 도구
Halsey 바늘 홀더, 5" 길이	Roboz 수술 기구	RS-7841	수술 도구
열 패드 - 15" x 21" - 최소 3개 필요	파라곤 메디컬	티피22G	Gaymar 히트 펌프와 함께 사용
케타민	약사/수의사		마취제 - 규제 물질
Prevantics 면봉	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	23-100-110	피부 수술 준비용
프롤렌 5-0 봉합사 테이퍼 30"	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	NC0256891	피부용 비흡수성 봉합사
Puralube 브랜드 안과 연고	패터슨 수의학	TEL.07-888-2572	수술 중 눈을 촉촉하게 유지하기 위해
Vicryl 5-0 봉합사 J303H	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	NC9816710	근육층을 위한 흡수성 봉합사
Wahl 미니 아르코 클리퍼	Med-Vet 국제	나 8787-1550	피부 준비를 위한 면도기

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