$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 세포의 이식
Renca 세포를 신장 내에 이식하려면 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에서 2 x 106 cells/mL의 단일 세포 현탁액으로 Renca 세포를 준비합니다.
- HBSS에서 0.25% 트립신을 사용하여 조직 배양 플라스크에서 부착 Renca 세포를 제거합니다. ~5분 후, 플라스크에 완전한 RPMI를 첨가하여 트립신을 중화하고 세포를 원심분리 튜브로 옮겨 세척합니다. 25°C에서 5분 동안 300 상대 원심력 g force(rcf x g)로 셀을 원심분리합니다.
- 상층액을 디캔팅하고 HBSS에서 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 HBSS로 부피를 조정하여 2 x 106 cells/mL를 산출합니다.
- 세포에 가해지는 전단 응력을 방지하기 위해 18게이지 바늘이 장착된 1mL 주사기로 세포를 끌어옵니다. 종양 세포를 주입하기 전에 18 게이지 바늘을 28 게이지 바늘로 교체하십시오. 0.1mL를 주사하면 2 x 105 세포가 신장으로 전달됩니다.
2. 수술 부위 준비
- 가열 패드 위에 멸균 수술용 드레이프를 놓아 생물 안전 캐비닛에 멸균 수술 부위를 준비합니다. 집게, 메스, 가위, 안약, 5% 포비돈 요오드 소독제, 멸균 거즈를 포함한 모든 용품을 모으십시오. 사용하기 전에 모든 기기를 오토클레이브하십시오.
- 무균 팁 기술을 사용하여 수술을 수행합니다. 비드 살균기로 동물 사이의 기구를 재살균합니다. 멸균 장갑, 실험복, 안면 마스크를 착용하십시오.
3. 동물 준비
- 기관 지침에 따라 케타민/자일라진(각각 87.5mg/kg 및 12.5mg/kg, ip)으로 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기를 수행하여 마취 깊이를 결정합니다.
- 동물이 반응이 없는 것으로 간주되는 경우, Balb/c 마우스의 털을 뽑거나(손가락으로) 면도하거나(이발기 사용하여) 주사 부위(예: 왼쪽 옆구리)를 준비합니다.
- 수술 준비 영역(예: 하우징 케이지)에서 수술 영역으로 마우스를 이동하고 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 도포합니다. 준비된 절개 부위에 5% 포비돈-요오드 소독제로 넉넉하게 면봉으로 닦습니다.
- 수술 전 진통제로 절개 부위에 부피바카인 염산염(2.5mg/mL 용액 0.1mL, s.c.)을 주사합니다.
- 멸균 메스나 가위를 사용하여 복막을 관통하지 않도록 조심스럽게 동물의 왼쪽 옆구리를 한 번 절개합니다(~1.0-1.5cm). 멸균 가위로 복막에서 진피를 분리합니다. 절개 부위를 멸균 면거즈로 두드려 피를 제거합니다.
- 양손으로 마우스를 잡고 왼손으로는 머리를 잡고 오른손으로는 측면을 지탱합니다.
- 복막을 통해 비장을 확인하고 오른손의 한 손가락으로 아래에서 마우스를 촉진하십시오. 이제 복막을 통해 신장을 볼 수 있어야 합니다. 복막과 신장 전체에 긴장을 주기 위해 동물을 단단히 잡으십시오.
- 두 번째 사람이 28게이지 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 온전한 복막을 통해 종양 세포(섹션 1.2에서 준비)를 신장 중앙에 주입하도록 합니다. 0.1mL(2 x 105)의 세포를 천천히 전달합니다. 세포가 주입되면 세포의 역류를 줄이기 위해 바늘을 5-10초 동안 제자리에 유지합니다.세포를 주입하는 사람이 바늘을 마우스를 들고 있는 사람의 손가락에 가깝게 가져갈 것이므로 이 단계에서는 각별한 주의가 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
- 바늘을 제거하고 시아노아크릴레이트 조직 접착제의 얇은 층으로 절개 부위를 닫습니다.
- 멸균 종이 타월로 동물을 깨끗한 우리에 다시 넣으십시오. 동물들이 발열 패드에서 회복할 수 있도록 합니다. 회복 기간 동안 동물을 방치하지 마십시오. 동물이 똑바로 서고 흉골이 될 때까지 표준 사육 조건으로 되돌리지 마십시오. 실험동물을 사용하는 모든 절차에서 제도적 지침을 따른다.