신세포암 모델 생성: 암세포의 신장 내 이식에 의한 정소성 RCC 쥐 모델을 개발하기 위한 프로토콜

초록

출처: Murphy, K. A. et al. 전임상 치료의 정량적 및 종단적 평가를 위한 전이성 신세포암의 Syngeneic Mouse Model. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오에서는 신세포암의 정소성 마우스 모델을 개발합니다. 이 모델은 주입된 신장에서 재현 가능한 원발성 종양과 폐에서 전이성 종양을 생성하여 질병 진행 및 치료를 평가할 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포의 이식

Renca 세포를 신장 내에 이식하려면 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에서 2 x 10⁶ cells/mL의 단일 세포 현탁액으로 Renca 세포를 준비합니다.

1. HBSS에서 0.25% 트립신을 사용하여 조직 배양 플라스크에서 부착 Renca 세포를 제거합니다. ~5분 후, 플라스크에 완전한 RPMI를 첨가하여 트립신을 중화하고 세포를 원심분리 튜브로 옮겨 세척합니다. 25°C에서 5분 동안 300 상대 원심력 g force(rcf x g)로 셀을 원심분리합니다.
2. 상층액을 디캔팅하고 HBSS에서 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 HBSS로 부피를 조정하여 2 x 10⁶ cells/mL를 산출합니다.
3. 세포에 가해지는 전단 응력을 방지하기 위해 18게이지 바늘이 장착된 1mL 주사기로 세포를 끌어옵니다. 종양 세포를 주입하기 전에 18 게이지 바늘을 28 게이지 바늘로 교체하십시오. 0.1mL를 주사하면 2 x 10⁵ 세포가 신장으로 전달됩니다.

2. 수술 부위 준비

1. 가열 패드 위에 멸균 수술용 드레이프를 놓아 생물 안전 캐비닛에 멸균 수술 부위를 준비합니다. 집게, 메스, 가위, 안약, 5% 포비돈 요오드 소독제, 멸균 거즈를 포함한 모든 용품을 모으십시오. 사용하기 전에 모든 기기를 오토클레이브하십시오.
2. 무균 팁 기술을 사용하여 수술을 수행합니다. 비드 살균기로 동물 사이의 기구를 재살균합니다. 멸균 장갑, 실험복, 안면 마스크를 착용하십시오.

3. 동물 준비

1. 기관 지침에 따라 케타민/자일라진(각각 87.5mg/kg 및 12.5mg/kg, ip)으로 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기를 수행하여 마취 깊이를 결정합니다.
2. 동물이 반응이 없는 것으로 간주되는 경우, Balb/c 마우스의 털을 뽑거나(손가락으로) 면도하거나(이발기 사용하여) 주사 부위(예: 왼쪽 옆구리)를 준비합니다.
3. 수술 준비 영역(예: 하우징 케이지)에서 수술 영역으로 마우스를 이동하고 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 도포합니다. 준비된 절개 부위에 5% 포비돈-요오드 소독제로 넉넉하게 면봉으로 닦습니다.
4. 수술 전 진통제로 절개 부위에 부피바카인 염산염(2.5mg/mL 용액 0.1mL, s.c.)을 주사합니다.
5. 멸균 메스나 가위를 사용하여 복막을 관통하지 않도록 조심스럽게 동물의 왼쪽 옆구리를 한 번 절개합니다(~1.0-1.5cm). 멸균 가위로 복막에서 진피를 분리합니다. 절개 부위를 멸균 면거즈로 두드려 피를 제거합니다.
6. 양손으로 마우스를 잡고 왼손으로는 머리를 잡고 오른손으로는 측면을 지탱합니다.
7. 복막을 통해 비장을 확인하고 오른손의 한 손가락으로 아래에서 마우스를 촉진하십시오. 이제 복막을 통해 신장을 볼 수 있어야 합니다. 복막과 신장 전체에 긴장을 주기 위해 동물을 단단히 잡으십시오.
8. 두 번째 사람이 28게이지 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 온전한 복막을 통해 종양 세포(섹션 1.2에서 준비)를 신장 중앙에 주입하도록 합니다. 0.1mL(2 x 10⁵)의 세포를 천천히 전달합니다. 세포가 주입되면 세포의 역류를 줄이기 위해 바늘을 5-10초 동안 제자리에 유지합니다.세포를 주입하는 사람이 바늘을 마우스를 들고 있는 사람의 손가락에 가깝게 가져갈 것이므로 이 단계에서는 각별한 주의가 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
9. 바늘을 제거하고 시아노아크릴레이트 조직 접착제의 얇은 층으로 절개 부위를 닫습니다.
10. 멸균 종이 타월로 동물을 깨끗한 우리에 다시 넣으십시오. 동물들이 발열 패드에서 회복할 수 있도록 합니다. 회복 기간 동안 동물을 방치하지 마십시오. 동물이 똑바로 서고 흉골이 될 때까지 표준 사육 조건으로 되돌리지 마십시오. 실험동물을 사용하는 모든 절차에서 제도적 지침을 따른다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인공 눈물 안과 연고	아콘	재질 보기 NDC 17478-162-35
Vetbond 티슈 접착제	3엠	CBGBIW011019
베타딘 용액 (포비돈요오드, 5%) NDC	퍼듀 제품, L.P.	67618-155-32
0.25% 마르카인 (부피바빈 HCl 주사제)	호스피라	TEL.0409-1587-50
발열 패드	광선
주사기 BD		309659
사	투기	908291
케타민	피닉스 제약 NDC	57319-609-02
자일라진	아콘 NDC	59399-111
행크스 밸런스드 솔트	시그마-알드리치	H2387
가위
집게
렌카	증권 시세	CRL-2947

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