역상 단백질 어레이 기반 단백질 발현 분석: 세포 용해물에서 여러 단백질의 발현을 동시에 정량화하기 위한 절차

Abstract

출처: O'Mahony, F. C. et al. 개별 신세포암 내 단백질 발현 변이를 탐색하기 위한 역상 단백질 어레이(RPPA)의 사용. J. Vis. 특급. (2013년)

이 동영상은 세포 용해물에서 단백질 발현 패턴을 연구하기 위해 역상 단백질 어레이(RPPA)를 수행하는 방법론을 보여줍니다. RPPA에서는 단백질 혼합물을 포함하는 용해물을 니트로셀룰로오스 슬라이드에 인쇄하고 관심 단백질을 형광 표지된 항체를 사용하여 분석합니다.

Protocol

1. RPPA 인쇄

1. 단백질 용해물은 MicroGrid II 로봇 탐지기를 사용하여 니트로셀룰로오스 코팅된 유리 슬라이드(Fastslides-Whatman)에서 발견되었습니다. 사용된 슬라이드에는 샘플이 발견된 2개의 패드가 포함되어 있습니다. 각 패드에는 동일한 샘플이 발견되었으며, 이 경우 100개의 샘플이 발견되었습니다. 사용 가능한 다른 형식으로는 1, 8 및 16 패드 슬라이드가 있습니다. 패드의 수가 많을수록 각각에서 발견할 수 있는 샘플의 수가 줄어듭니다.
2. 각 샘플에서 일련의 5개의 2배 희석이 이루어진 다음 각각을 3회씩 발견했습니다(결과적으로 샘플당 총 15개의 반점이 생성됨).

2. RPPA 단백질 검출

1. 과도한 LiCor Blocking Buffer(PBS에서 50:50으로 희석)의 젖은 슬라이드. 흔들리는 플랫폼에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
2. LiCor Blocking Buffer(PBS에서 50:50으로 희석됨)에 원하는 농도로 800μL의 1차 항체를 준비하고 얼음에 보관합니다.
3. (i) 단일 프레임 칩 클립 또는 (ii) 'FastFrame' 4베이 슬라이드 홀더에 슬라이드를 장착하여 슬라이드와 배양 챔버 사이에 단단한 밀봉이 형성되도록 합니다.
4. 웰에서 잔류 완충액을 제거하고 각 웰에 600μL 1차 항체를 추가합니다.
5. 슬라이드와 챔버를 밀봉된 습식 상자에 넣고 4°C에서 밤새 흔들리는 플랫폼에서 배양합니다.
6. 0.1% PBS-Tween20(PBS-T, 100μL Tween 20/100mL PBS)을 구성합니다.
7. 냉장실에서 슬라이드를 제거하고 각 웰에서 1차 항체를 조심스럽게 제거합니다.
8. 600μL의 PBS-T를 추가하고 RT에서 5분(X3) 동안 흔들 플랫폼에서 슬라이드를 세척합니다.
9. 1차 인스턴스에서 1:2,000 희석(1 μL/2 mL)으로 0.01% SDS를 Odyssey Blocking Buffer(PBS에서 50:50으로 희석)하여 형광 표지된 2차 항체를 준비합니다.
10. 웰에서 완충액을 제거하고 600μL 형광 표지된 2차 항체를 각 웰에 추가합니다. 2차 항체를 실온에서 45분 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 최종적으로 스캔될 때까지 멤브레인을 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다.
11. 웰에서 2차 항체를 제거하고 실온에서 600μL PBS-T로 짧게(x3) 세척합니다. 캐리어에서 슬라이드를 제거하고 적절한 용기로 옮긴 다음 멤브레인을 어두운 곳에 유지하면서 15분 동안 과도한 PBS-T를 세척합니다.
12. PBS-T를 제거하고 실온에서 15분 동안 PBS로 멤브레인을 추가로 세척하여 잔류 Tween-20을 제거하고 멤브레인을 다시 어두운 곳에 유지합니다.
13. 패스트슬라이드를 50°C 오븐에서 10분 동안 건조시킨 다음 Li-Cor Odyssey 스캐너에서 스캔합니다. 스캔할 때까지 슬라이드를 어두운 곳에 두십시오.
14. 사용된 2차 항체/항체에 따라 680nm 및/또는 800nm에서 슬라이드를 스캔합니다. 2색 검출의 경우 항상 교차 흡착이 심한 2차 항체를 사용하여 교차 반응을 최소화하십시오. 1차 및 2차 항체의 신중한 선택은 2색 검출을 위해 필요합니다. 가장 중요한 것은 두 가지 주요 항체에 대해 서로 다른 숙주 종(예: 토끼 및 마우스)을 선택하는 것입니다. 이를 통해 쉽게 구별할 수 있는 방출 스펙트럼을 가진 염료로 표지된 anti-rabbit 및 anti-mouse 2차 항체를 구별할 수 있습니다.
15. 이미지 파일은 .tiff 파일로 저장됩니다. 그림 1은 스캔된 파일의 이미지를 보여줍니다.

Results

그림 1. RPPA 스캐닝 프로세스의 흐름도.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
트리톤 X-100	트리톤-X	T8787
Li-Cor Odyssey 블로킹 버퍼	리코르	927-40000
MicroGrid II 로봇 감시계	바이오로보틱스
FastFrame' 4베이 슬라이드 홀더	왓맨	10486001
패스트 슬라이드 - 2패드	왓맨	10485317
IRDye 680LT 염소 안티 마우스 IgG	라이코	전화:926-68020
IRDye 800CW 염소 안티 토끼 IgG	라이코	전화: 926-32211