제브라피시 배아에 네프로톡신의 정맥 미량 주입: 제브라피시 배아의 혈류로 신독성 물질을 전달하는 기술

초록

출처: McKee, Robert A. et al. 급성 신장 손상을 모델링하기 위해 제브라피쉬에 네프로톡신 미량 주입. J. Vis. 특급(2016년)

이 비디오는 신장 기능에 대한 화학적 영향을 연구하기 위해 제브라피시 배아의 꼬리 정맥에 네프로톡신을 정맥 미량 주입하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 증류수 5L에 NaCl 73.0g, KCl 3.15g, CaCl 9.15g 2 및 MgSO₄ 9.95g을 혼합하여 E3 배아 배지의 50배 원액을 만들고 RT에서 보관합니다.
2. 증류수 5L에 NaCl 73.0g, KCl 3.15g, CaCl 9.15g 2 및 MgSO₄ 9.95g을 혼합하여 E3 배아 배지의 50배 원액을 만들고 RT에서 보관합니다.
3. 제브라피시 배아를 배양하려면 E3 배아 배지 스톡의 50x 스톡 용액을 증류수와 함께 1x 작업 용액에 희석한 다음 살균제 역할을 하는 1x E3 1L마다 0.05% 메틸렌 블루 200μl를 첨가하고 RT에 보관합니다.
4. 50x E3 스톡 40mL와 0.06mg PTU를 결합하여 0.003% 1-페닐-2-티오우레아(PTU)를 함유한 E3 배아 배지의 색소 침착 차단 용액을 만듭니다. 그런 다음 증류수로 부피를 총 2L로 가져옵니다.
5. RT에서 E3/PTU O/N을 저어 PTU 분말을 용액에 넣습니다. 그런 다음 E3/PTU를 RT.
   에 저장합니다. 메모: E3/PTU의 유통 기한은 약 1주일이며, 오래된 용액은 제브라피시 유충의 색소 발달을 차단하는 데 덜 효과적입니다.
6. 증류수 500mL에 트리카인 1g을 첨가하여 0.2% 트리카인(MS-222)의 마취액을 만들고 1M 트리스, pH 9.5로 pH를 7.2로 조정합니다.

2. 도구 준비

1. 5인치 직선 해부 바늘 끝에 젤 로딩 팁을 부착하여 미세 주입을 위해 배아를 배치하는 데 사용되는 배아 조작 도구를 준비하고 테이프 또는 초강력 접착제로 고정합니다.
2. 바늘 풀러를 사용하여 먼저 필라멘트가 있는 화염 광택 10cm 붕규산 유리를 기구에 넣고 손잡이를 조여 붕규산 유리를 고정하여 미세 주입 바늘을 준비합니다.
3. 붕규산 유리를 당겨 가늘게 가늘어지는 바늘을 만듭니다. heat 540, pull 245, velocity 200 및 time 125 설정을 사용합니다.
4. 페트리 접시 안에 바늘을 넣고 바늘 끝을 보호하기 위해 모델링 점토 스트립에 매달아 놓고 먼지가 쌓이지 않도록 접시를 덮어 두십시오.
5. 미세 주입을 위한 바늘 준비를 마치려면 면도날이나 가는 집게를 사용하여 바늘의 당겨진 끝을 잘라 직경 약 0.05–0.1mm의 날카로운 각도 주입 팁을 만듭니다.
6. 미세주입 트레이를 만들려면 100mL 삼각 플라스크에 1.5% 아가로스/E3 용액을 준비하고 E3를 전자레인지에서 끓여서 아가로스를 용해한 다음 약 10분 동안 상온에서 냉각시킵니다.
7. 냉각된 아가로스/E3 용액을 페트리 접시에 붓고 약 0.5cm 깊이의 파운데이션을 만듭니다. 이것이 응고되면 약 0.3cm 깊이의 두 번째 층을 붓고 조립식 배아 웰 몰드를 삽입하고 아가로스가 RT.
   에서 응고되도록 합니다. 메모: 상단 한천/E3 층에 금형을 삽입할 때 금형을 한천에 비스듬히 배치하여 기포 수를 줄입니다.
8. 전체 미세 주입 트레이가 설정되면 스쿠퓰라를 사용하여 조립식 배아 웰 몰드를 천천히 조심스럽게 들어 올린 다음 접시에 E3 용액을 채우고 4°C에서 보관합니다.

3. 네프로톡신 용액의 미량 주입

1. 주사 당일에는 적절한 차량 제어 장치와 함께 원하는 네프로톡신 용액을 준비합니다.
2. 약물이 용액에 있는지 확인하기 위해 부드럽게 소용돌이치거나 혼합하고 튜브의 측면과 물기둥의 상단을 확인합니다.
   메모: 네프로톡신 용액은 미량의 형광 접합 덱스트란을 함유하도록 제조하여 미량주입 효율을 모니터링하고 후속 시점에서 신장 청소율을 평가할 수 있습니다.
3. 미세한 젤 로딩 팁을 바늘 뒤쪽에 끼워 잘라낸 미세주입 바늘에 네프로톡신을 ~2–3μL씩 끼우고 바늘을 테이프 조각으로 수직으로 매달아 용액이 중력에 의해 잘린 바늘 끝을 채울 수 있도록 합니다.
4. 바늘 끝이 가득 차면 장전된 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다.
5. 마이크로미터 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 떨어뜨려 미량 주입량을 테스트하고 오일에 주입하여 액적 크기를 평가합니다. 500 pl의 주입량은 0.1 mm의 직경을 갖는다.
6. 인큐베이터에서 배아 접시를 꺼내고 배아 접시에 약 5mL의 0.2% 트리카인을 첨가하여 마취합니다.
7. 완전한 마취를 위해 배아 매니퓰레이터 도구의 끝으로 배아를 부드럽게 만집니다. 움직임이 부족하면 충분한 마취가 이루어졌음을 나타냅니다.
8. 성공적인 마취 후, 이송 피펫을 사용하여 배아를 사출 금형으로 이식합니다.
9. 각 배아를 곰팡이의 다른 우물로 이동시켜 머리를 우물의 가장 깊은 곳에 배치하여 몸통이 함몰부를 따라 놓이고 꼬리가 함몰부에서 튀어나오
도록 합니다.
10. 채워진 바늘을 미세 조작기에 삽입하고 바늘 끝을 배아 옆에 놓습니다.
11. 조이스틱을 앞으로 움직여 바늘을 꼬리 혈관에 부드럽게 삽입하고 풋 페달을 밟아 미세 주입을 전달합니다.
    메모: 성공적인 주입은 액체가 순환에 들어가는 것을 관찰하여 측정할 수 있습니다. 또한, 신독성제와 형광 접합 덱스트란을 동시 주입하면 연구자는 시술 후 성공적인 주입을 확인할 수 있습니다.
12. 조이스틱을 부드럽게 뒤로 당겨 배아에서 바늘을 제거합니다.
13. 주입 후 배아를 깨끗한 접시에 옮기고 헹구어 트리카인을 제거하고 새 E3/PTU로 교체합니다.
14. 형태를 평가하기 위해 원하는 시점으로 배아를 배양하고, 이는 메틸셀룰로오스 장착 매체에서 사진으로 문서화하거나 원하는 대로 실험 분석을 위해 처리할 수 있습니다.
    메모: 배아의 회복은 일반적으로 신장 손상을 나타내는 부종이 있는 개인의 비율을 결정하기 위해 평가해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소금	미국 생물 분석	AB01915
염화칼륨	미국 생물 분석	AB01652
마그네슘 황산염	시그마-알드리치	M7506
염화칼슘	미국 생물 분석	AB00366
N-페닐티오우레아(PTU)	알드리치 화학	P7629
에틸 3-아미노벤조에이트(트리카인)	Fluka 분석	A5040
붕규산 유리	셔터 인스트루먼트 Co.	재질 보기 BF100-50-10
화염/갈색 마이크로피펫 풀러	셔터 인스트루먼트 Co.	월. P097
울트라퓨어 아가로스	인비트로젠	제15510-027
Falcon Diposable Petri Dish, 멸균, 코닝:
60mm x 15mm	폭스바겐	제25373-085
100mm x 15mm	폭스바겐	제25373-100
마이크로 사출 트레이 150mm x 15mm	폭스바겐	25373-187
저온 인큐베이터	피셔 사이언티픽	11 690 516DQ
마이크로 해부 핀셋	Roboz 수술 기구 Co.	RS-5010
마이크로미터	테드 펠라, Inc.	2280-24

(영문) 호 호 호 년 시리즈 년