Kidney Flat Mount Preparation: 성체 제브라피시 신장의 현미경 분석을 위해 Flat Mount를 해부하고 준비하는 절차

초록

출처: McCampbell, K. K. et al. 성체 제브라피시 신장의 네프론 구성 및 기능 분석.J. Vis. 특급 (2014)

이 비디오는 성체 제브라피시 신장의 평평한 마운트를 해부하고 준비하는 방법을 보여줍니다. 준비된 플랫 마운트는 표본 분석을 위해 현미경으로 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 근위세뇨관의 형광 덱스트란 라벨링을 시각화하기 위해 고정되지 않은 동물 샘플에서 성체 제브라피시 신장의 해부 및 플랫 마운트 준비

1. 덱스트란을 주입한 성체 제브라피시를 0.2% 트리카인 pH 7.0의 접시에 4-5분 동안 넣어 안락사시킵니다.
   메모: 진행하기 전에 아가미가 움직임을 멈추고 심장 박동이 멈췄는지 주의 깊게 모니터링하여 물고기가 안락사되었는지 확인하십시오.
2. 플라스틱 숟가락을 사용하여 트리카인 용액에서 생선을 들어 올리고 용액을 디캔팅한 다음 동물을 티슈나 종이 타월 위에 올려 놓습니다.
3. 날카로운 해부 가위를 사용하여 아가미 수술 뒤를 자르고 머리를 제거합니다.
4. 즉시 해부 가위로 머리에서 꼬리 지느러미 기저부까지 긴 복부 절개를 만들어 물고기의 몸을 엽니다.
5. 한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 물고기의 내부 장기를 제거하십시오.
6. 초미세 박리 바늘을 사용하여 체벽을 핀으로 열어 동물의 등벽에 부착된 신장 기관을 시각화할 수 있습니다.
7. 가는 집게를 사용하여 등벽에서 신장을 분리합니다.
8. 1X PBS가 들어있는 5mL 유리 바이알에 신장을 부드럽게 넣고 3-5mL의 신선한 1X PBS로 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
   메모: 성인 신장 샘플을 취급하기 위해 유리 바이알을 사용하면 조직의 시각화가 용이하고 약 3-5mL의 큰 부피(조직 질량에 비해)로 세척할 수 있습니다. 대안적으로, 12-웰 세포 배양 접시를 사용할 수 있다. 플라스틱 미세 원심분리기 튜브를 사용할 수 있지만 표준 크기의 튜브(1.5mL)는 세척을 제한할 수 있습니다.
9. 전사 피펫으로 신장을 제거하고 1X PBS 1-2방울과 함께 깨끗한 유리 슬라이드에 놓습니다.
10. 가는 집게를 사용하고, 슬라이드에서 신장을 평평하게 하고, 조직이 말리거나 뒤집히지 않았는지 확인합니다.
    메모: 또는 텅스텐 와이어 도구를 사용하여 결합 조직에 작은 절개를 만들어 신장의 평평한 위치를 용이하게 할 수 있습니다.
11. 18 x 18mm 유리 커버슬립의 각 모서리에 작은 모델링 점토 조각을 놓고 커버슬립을 신장에 천천히 놓습니다.
    메모: 용액에 기포가 갇히는 것을 최소화하기 위해 배치하는 동안 커버슬립의 각도를 약간 맞춥니다. 모델링 점토 디봇의 직경은 약 2mm입니다(그림 1A). 또는 모델링 점토 대신 진공 그리스의 디봇을 대체할 수 있습니다. 필요한 경우 커버슬립과 유리 슬라이드 사이의 공간을 채우기 위해 1X PBS 한 방울을 더 추가합니다.
12. 적절한 필터가 있는 실체현미경 또는 복합 현미경의 시야에 유리 슬라이드를 배치하여 신장을 관찰 및/또는 이미지
화합니다.

결과

그림 1. 성체 제브라피시 신장 플랫 마운트 준비 및 적용은 신장 네프론의 PCT 분절에서 공액 덱스트란 흡수를 시각화합니다. (가)신장 표본 플랫 마운트 준비의 명시야 이미지로, 장기가 유리 슬라이드에 평평하게 배치되어 있으며, 모델링 점토(핫 핑크색)의 4개의 디봇에 놓인 조직 위에 커버슬립이 놓여 있습니다. 여기에서 신장 제제는 스케일링된 비교를 제공하기 위해 미터법 눈금자와 함께 이미지화됩니다. 일반적인 성인 신장은 머리에서 꼬리까지 약 5-7mm입니다.(B) 표백되지 않은 신장의 명시야 이미지. 검은색 색소 침착은 신장과 관련하여 발견되는 멜라닌 세포의 흩어져 있는 집단에 해당하며, 대동맥은 신장의 정중선을 따라 흐릅니다.(C) 성인 신장의 표백 없이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1X PBS			10 X PBS를 증류수에 희석하여 만듭니다.
가는 집게	로보즈	RS-1050	Dumont 핀셋 패턴 #55
유리 슬라이드	써모 피셔	4445	화이트 프로스트
유리 커버슬립	써모 피셔	12-540ᅡ	18 x 18 밀리미터
점토 모델링	하스브로	플레이도	다른 모델링 점토로 대체하여 유사하게 작동할 수 있습니다.
슬라이드 홀더	써모 피셔	12-587	선택 사항: 슬라이드를 평평하게 보관하기 위한 판지 트레이.
실체현미경	니콘	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-블루 GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC	사용된 필터 세트는 다음과 같습니다: Hoechst/DAPI 필터는 DAPI, 요오드화 프로피듐, 덱스트란 캐스케이드 블루 및 알칼리성 인산가수분해효소 검출에 사용되었습니다. GFP/FITC 필터는 dextran-FITC, dextran lucifer yellow 및 antiGFP 검출에 사용되었습니다. TRITC 필터는 덱스트란-플루오로-루비, PI 및 DBA 검출에 사용되었습니다.
복합 현미경	니콘	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C 텍사스 레드	사용된 필터 세트는 다음과 같습니다: Hoechst/DAPI 필터는 DAPI, 요오드화 프로피듐, 덱스트란 캐스케이드 블루 및 알칼리성 인산가수분해효소 검출에 사용되었습니다. GFP/FITC 필터는 dextran-FITC, dextran lucifer yellow 및 antiGFP 검출에 사용되었습니다. Texas Red 필터는 덱스트란-플루오로-루비, PI 및 DBA 검출에 사용되었습니다.