제브라피쉬 신장의 탈색 및 선염색: 염색을 위해 성체 제브라피시 신장을 준비하는 기술

초록

출처: McCampbell, K. K. et al. 성체 제브라피시 신장의 네프론 구성 및 기능 분석. J. Vis. 특급 (2014년)

이 비디오에서는 성체 제브라피시 신장의 탈색과 염색 절차를 위한 후속 준비를 보여줍니다. 염색 후, 성체 제브라피시 신장은 신장 재생, 신장 질환 모델의 표현형 특성 분석 및 네프론 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 성체 제브라피시 신장의 고정, 해부, 투과 및 색소 침착 제거

1. 4% 파라포름알데히드(PFA)/1X PBS/0.1% DMSO의 새로운 정착 용액을 준비하거나 4% PFA/1X PBS의 냉동 분취액을 해동하고 0.1% DMSO.
   를 추가합니다. 주의: PFA는 독성이 있으므로 PFA 용액은 장갑과 실험복을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용한 상태에서 화학 후드에서 취급해야 합니다. 또한 PFA 분말은 원액을 만들 때 주의해서 취급해야 합니다.
2. 해부 트레이에 동물 전체가 잠길 수 있을 만큼 충분한 정착액을 채웁니다.
3. 선택한 제브라피시를 안락사시키고 고정 용액에 장착합니다.
   메모: 선택된 물고기는 처리되지 않은 제브라피쉬 신장 표본 또는 이전에 복강내 덱스트란 주사를 받은 제브라피쉬에서 분리된 신장일 수 있습니다.
4. 샘플 수정ample O/N(12–16시간)을 4^°C에서 사용합니다.
5. 다음 날, 가는 집게를 사용하여 등쪽 체벽에서 신장을 조심스럽게 분리하고 전사 피펫을 사용하여 장기를 유리 바이알에 넣습니다.
   참고: 또는 12웰 또는 24웰 배양 접시를 사용할 수 있습니다. 플라스틱 미세 원심분리기 튜브를 사용할 수 있지만 표준 크기의 튜브(1.5mL)는 세척을 제한할 수 있습니다.
6. 절개된 신장을 0.05% 트윈이 있는 3-5mL의 1X PBS로 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
7. 0.05% Tween으로 1X PBS를 제거하고 30분 동안 5% 자당 용액(1X PBS에서) 3mL로 신장을 헹굽니다.
8. 30% 자당 용액 3mL(1X PBS)로 교체하고 O/N(12–16시간)을 4o C.
   에서 보관합니다. 참고: 자당 용액은 세포막을 투과화하여 시약이 조직에 침투할 때 시약의 특정 표지를 허용합니다.
9. 다음날, 30% 자당 용액을 제거하고 0.05% 트윈이 있는 5X PBS 5mL로 각각 5분씩 신장을 세척합니다.
10. 1X PBS를 0.05% 트윈으로 교체하고 3-5mL의 표백 용액으로 교체하여 신장 장기에 존재하는 멜라닌 세포 색소 침착을 제거합니다.
11. 유리 바이알을 회전기에 놓고 색소 침착이 사라지는 것을 주의 깊게 관찰합니다.
    참고: 탈색은 일반적으로 자당 처리 후 수행할 때 약 20분이 소요되지만 때로는 60분까지 걸릴 수 있습니다. 표백 용액을 신장에 너무 오래 방치하면 장기의 분해가 발생할 수 있습니다. 조직 무결성을 확인하기 위해 10-15분마다 샘플을 모니터링하는 것이 좋습니다.
12. 신장에서 색소 침착이 제거되면 0.05% Tween이 함유된 3-5mL의 1X PBS로 두 번 세척합니다.
13. RT에서 1시간 동안 0.05% Tween이 있는 1X PBS를 3-5mL의 4% PFA 용액으로 교체합니다.
14. 4% PFA 용액을 제거하고 0.05% Tween이 있는 1X PBS 3-5mL로 각각 5분 동안 신장을 3회 세척합니다.
    참고: 고정이 완료되면 신장도 유리 슬라이드에 장착하고 멜라닌 세포 색소 침착이 없는 덱스트란 흡수를 평가할 수 있습니다.
15. 0.05% Tween이 함유된 1X PBS를 제거하고 3-5mL의 차단 용액으로 대체한 다음 블록에서 RT로 신장을 2시간 동안 배양합니다.
16. 차단이 완료되면 선택한 염색 프로토콜로 바로 진행합니다.
    참고: 이제 다른 시약으로 표지 연구를 수행하기 위해 하나 이상의 다른 절차를 통해 신장을 처리할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1X PBS			10X PBS를 증류수에 희석하여 제작
PBST 1개			0.1X PBS의 20% Tween-1 세제
1X PBS(0.05% 트윈)			0.05X PBS의 20% Tween-1 세제
트윈 20	미국 생물 분석	AB02038
4% PFA/1X PBS			4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat #19210)를 1X PBS에 녹여 흄 후드의 핫 플레이트에서 끓입니다. 부분 표본을 식히고 얼려 -20°C의 냉동실에 보관합니다. 사용 직전에 해동하고 재고를 다시 얼리지 마십시오.
표백 용액			표백제 혼합 공식 (20ml 용액 용) : 10 % 수산화 칼륨 용액 1.6ml 30 % 과산화수소 용액 0.6ml 20 % 트윈 100 μl에 증류수로 20 ml를 채 웁니다
수산화칼륨	시그마	221473
과산화수소	시그마	H1009
차단 솔루션			차단 용액(10ml 용액의 경우): 0.05% Tween 2ml의 태아 송아지 혈청이 포함된 1X PBS 8ml DMSO 150μl

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