확장 병리학: 임상 조직 샘플의 고해상도 광학 이미징 방법

Abstract

출처: Klimas, A. et al. 물리적 및 등방성 확장을 통한 인체 조직 절편의 나노 이미징.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오에서는 나노 단위 구조의 현미경 검사를 위해 폴리머 네트워크를 사용하여 임상 조직 표본을 화학적으로 확장하는 확장 현미경 검사의 변형인 확장 병리학이라는 방법에 대해 설명합니다.

Protocol

1. 시편의 현장 중합

1. 시편을 고정 용액에서 배양합니다.
   1. 1x PBS의 AcX 원액을 비알데히드 고정제로 고정된 샘플의 경우 0.03mg/mL, AcX와 반응할 수 있는 유리 아민이 적은 알데히드 고정제로 고정된 샘플의 경우 0.1mg/mL의 농도로 희석하여 앵커링 용액(일반적으로 250μL이면 조직 단면을 덮기에 충분)을 준비합니다.
   2. 슬라이드를 100mm 페트리 접시에 놓고 고정 용액을 조직 위에 피펫으로 씌웁니다. 상온에서 최소 3시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
2. 샘플을 겔화 용액에서 배양합니다.
   1. 최소 100배 이상의 겔화 용액을 준비합니다. 200 μL당 188 μL의 단량체 용액, 4 μL의 0.5% 4HT 원액(1:50 희석, 최종 농도: 0.01%), 4 μL의 10% TEMED 원액(1:50 희석, 최종 농도 0.2%), 4 μL의 10% APS 원액(1:50 희석, 최종 농도 0.2%).
      참고: 겔화 용액은 사용 직전에 만들어야 합니다. 용액은 4°C로 유지해야 하며 APS 용액은 조기 겔화를 방지하기 위해 마지막에 첨가해야 합니다.
   2. 조직 섹....

Results

그림 1: 병리학 샘플용 겔화 챔버.(A) 다이아몬드 나이프로 절단된 #1.5 커버 유리 두 조각과 같은 두 개의 스페이서를 4°C에서 겔화 용액에 샘플을 배양한 후 조직의 양쪽에 배치합니다. 스페이서는 샘플의 압축을 방지하기 위해 조직 절편보다 두꺼워야 합니다. (B) #1.5 커버 유리 조각과 같은 뚜껑은 37°C에서 배양하기 전에 샘플을 덮는 데 사용됩니다.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6웰 유리 바닥판(#1.5 커버글라스)	셀비스	P06-1.5H-N
아세톤	피셔 사이언티FC	대답18-500
아크릴아마이드	시그마 알드리치	A8887
아크릴로일-X SE, (AcX)	인비트로젠	A20770
아가로스	피셔 사이언티FC	BP160-100
과황산암모늄(APS)	시그마 알드리치	A3678	이니티에이터
다피(1mg/mL)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	62248	핵 염색
다이아몬드 나이프 No. 88 CM	일반 도구	31116
에탄올	팜코	111000200
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 0.5 m	폭스바겐	BDH7830-1
FFPE 신장 샘플	USB아이오맥스	휴FPT072
집게
마이크로 커버 유리 #1 (24 mm x 60 mm)	폭스바겐	48393 106
마이크로 커버 유리 #1.5 (24 mm x 60 mm)	폭스바겐	48393 251
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)	시그마 알드리치	T9281	가속기
N,N'-메틸렌비스아크릴아미드	시그마 알드리치	M7279
Nunclon 6-Well 세포 배양 접시	써모 피셔	140675
Nunc 15 mL 원뿔형	써모 피셔	339651
Nunc 50 mL 원뿔형	써모 피셔	339653
오비탈 셰이커
페인트 브러시
pH 측정기
인산염 완충 식염수(PBS) 10x 용액	피셔 사이언티FC	BP399-1
플라스틱 페트리 접시 (100mm)	피셔 사이언티FC	FB0875713
Proteinase K (분자생물학 등급)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	EO0491
면도날	피셔 사이언티FC	12640
Safelock 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL	써모 피셔	3457
Safelock 마이크로 원심분리기 튜브 2.0 mL	써모 피셔	3459
아크릴산 나트륨	시그마 알드리치	제408220
소금	시그마 알드리치	S6191
구연산나트륨 tribasic dihydrate	시그마 알드리치	C8532-1KG
트리스 베이스	피셔 사이언티FC	BP152-1
트리톤 X-100	시그마 알드리치	T8787
크실렌	시그마 알드리치	214736