확장 병리학: 임상 조직 샘플의 고해상도 광학 이미징 방법

초록

출처: Klimas, A. et al. 물리적 및 등방성 확장을 통한 인체 조직 절편의 나노 이미징.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오에서는 나노 단위 구조의 현미경 검사를 위해 폴리머 네트워크를 사용하여 임상 조직 표본을 화학적으로 확장하는 확장 현미경 검사의 변형인 확장 병리학이라는 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 시편의 현장 중합

1. 시편을 고정 용액에서 배양합니다.
   1. 1x PBS의 AcX 원액을 비알데히드 고정제로 고정된 샘플의 경우 0.03mg/mL, AcX와 반응할 수 있는 유리 아민이 적은 알데히드 고정제로 고정된 샘플의 경우 0.1mg/mL의 농도로 희석하여 앵커링 용액(일반적으로 250μL이면 조직 단면을 덮기에 충분)을 준비합니다.
   2. 슬라이드를 100mm 페트리 접시에 놓고 고정 용액을 조직 위에 피펫으로 씌웁니다. 상온에서 최소 3시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
2. 샘플을 겔화 용액에서 배양합니다.
   1. 최소 100배 이상의 겔화 용액을 준비합니다. 200 μL당 188 μL의 단량체 용액, 4 μL의 0.5% 4HT 원액(1:50 희석, 최종 농도: 0.01%), 4 μL의 10% TEMED 원액(1:50 희석, 최종 농도 0.2%), 4 μL의 10% APS 원액(1:50 희석, 최종 농도 0.2%).
      참고: 겔화 용액은 사용 직전에 만들어야 합니다. 용액은 4°C로 유지해야 하며 APS 용액은 조기 겔화를 방지하기 위해 마지막에 첨가해야 합니다.
   2. 조직 섹션에서 여분의 용액을 제거하고 슬라이드를 100mm 페트리 접시에 넣습니다. 샘플에 신선하고 차가운 겔화 용액을 추가하고 용액이 조직으로 확산될 수 있도록 4°C에서 30분 동안 조직에서 혼합물을 배양합니다.
3. 겔화 용액을 방해하지 않고 샘플 주위의 슬라이드에 챔버를 구성합니다(그림 1A).
   1. 다이아몬드 나이프를 사용하여 커버 유리 조각을 얇게 절단하여 겔화 챔버용 스페이서를 만듭니다.
      참고: 확장 후 이미징을 용이하게 하려면 스페이서가 조직 표본에 가까운 두께를 유지하여 조직 위의 빈 젤의 양을 줄여야 합니다. Number 1.5 glass는 표준 임상 샘플(5-10μm)에 사용할 수 있습니다. 더 두꺼운 샘플을 위해 커버 유리 조각을 쌓을 수 있습니다.
   2. 물방울(~10μL)을 사용하여 조직의 양쪽에 스페이서를 고정합니다.
   3. 덮개 유리 뚜껑을 슬라이드 위에 조심스럽게 놓고 조직 위에 기포가 끼지 않도록 합니다(그림 1B).
4. 샘플을 37°C의 가습 환경(예: 젖은 물티슈가 있는 밀폐된 페트리 접시)에서 2시간 동안 배양합니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드 챔버는 4°C에서 밀봉된 페트리 접시 내부에 보관할 수 있습니다.

2. 시료 분해

1. 면도날을 커버슬립 아래로 부드럽게 밀어 겔화 챔버의 뚜껑을 제거하고 커버슬립을 젤 표면에서 천천히 들어 올려 겔화 챔버의 뚜껑을 제거합니다. 부피를 최소화하기 위해 조직 주위의 빈 젤을 다듬습니다. 균질화 후 겔의 방향을 추적하기 위해 겔을 비대칭으로 절단합니다., 샘플이 투명해지기 때문에.
   1. 사용하기 전에 ProK를 분해 완충액(최종 농도 4U/mL)에서 1:200으로 희석합니다. 젤이 완전히 잠길 수 있는 충분한 용액을 준비하십시오. 4웰 플라스틱 세포 배양 플레이트의 단일 웰에는 웰당 최소 3mL가 필요합니다.
   2. 분해 완충액이 들어있는 밀폐된 용기에 시료를 60°C에서 3시간 동안 배양합니다. 만약 샘플이 분해 중에 슬라이드에서 분리되지 않으면 면도날을 사용하여 샘플을 부드럽게 제거하십시오.
      알림: 샘플이 마르는 것을 방지하기 위해 표본을 소화 완충액에 완전히 담가야 하며 필름으로 밀봉할 수 있는 덮개가 있는 용기(작은 슬라이드 상자, 플라스틱 우물, 페트리 접시 등)에 넣어야 합니다.

3. 시료 확장 및 이미징

1. 부드러운 붓을 사용하여 원하는 이미징 시스템과 호환되고 완전히 팽창된 젤을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 용기에 표본을 1x PBS로 옮깁니다. 이미징 대물렌즈에서 샘플까지의 거리를 최소화하기 위해 거꾸로 된 시스템에서 이미징하는 경우 샘플 면이 아래로, 수직 시스템에서 이미징하는 경우 위로 조직을 배치해야 합니다. 필요한 경우 부드러운 붓을 사용하여 젤을 뒤집습니다.
   메모: LED의 측면 조명을 사용하여 액체에서 볼 수 있습니다. 표준 6웰 플레이트는 미리 확장된 직경이 0.6cm 미만인 샘플을 수용할 수 있습니다. 유리 바닥 웰 플레이트는 반전 시스템에서 이미징하는 데 사용해야 합니다.
2. 10분 동안 RT에서 1x PBS로 샘플을 세척합니다. 원하는 경우 분해 과정에서 DAPI 염색이 씻겨 나갈 때 300nM DAPI로 샘플을 다시 염색합니다. PBS를 제거하고 RT에서 20분 동안 1x PBS에 희석한 300nM DAPI로 염색한 다음 RT.
   에서 1x PBS로 10분 세척합니다. 참고: 샘플은 1x PBS로 덮고 다음 단계로 진행하기 전에 4°C에서 보관할 수 있습니다.
3. 샘플을 확장하려면 PBS를 교체하고 초과량의 ddH₂O(최종 겔 부피의 최소 10배)로 RT.
   에서 각각 10분 동안 3-5회 세척합니다. 메모: 3^번째 또는 4^번째 세척 후에는 표본의 팽창이 안정되기 시작해야 합니다. 저장을 위해 박테리아 성장을 방지하기 위해 ddH₂O에 0.002%-0.01% 아지드화나트륨(NaN₃)을 보충할 수 있습니다. 이 경우 최종 팽창 계수는 10% 가역적으로 감소합니다.
4. 기존의 광시야 현미경, 컨포칼 현미경 또는 기타 선택한 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다.
   메모: 젤이 표류하는 것을 방지하기 위해 우물에서 과도한 액체를 제거할 수 있습니다. 겔은 또한 1.5-2% 저용융 아가로스로 고정할 수 있습니다. 용액 부피의 2-4 배의 용기에 물에 1.5-2 % (w / v) 저용융 아가로 오스를 준비합니다. 용액을 40°C 수조 또는 전자레인지에서 10-20초 동안 데워 용액을 녹입니다. 젤의 가장자리 주위에 녹은 아가로스를 피펫으로 만듭니다. 아가로스가 RT 또는 4°C에서 굳어지도록 한 후 탈수를 방지하기 위해 샘플에 물을 첨가합니다.

결과

그림 1: 병리학 샘플용 겔화 챔버.(A) 다이아몬드 나이프로 절단된 #1.5 커버 유리 두 조각과 같은 두 개의 스페이서를 4°C에서 겔화 용액에 샘플을 배양한 후 조직의 양쪽에 배치합니다. 스페이서는 샘플의 압축을 방지하기 위해 조직 절편보다 두꺼워야 합니다. (B) #1.5 커버 유리 조각과 같은 뚜껑은 37°C에서 배양하기 전에 샘플을 덮는 데 사용됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 유리 바닥판(#1.5 커버글라스)	셀비스	P06-1.5H-N
아세톤	피셔 사이언티FC	대답18-500
아크릴아마이드	시그마 알드리치	A8887
아크릴로일-X SE, (AcX)	인비트로젠	A20770
아가로스	피셔 사이언티FC	BP160-100
과황산암모늄(APS)	시그마 알드리치	A3678	이니티에이터
다피(1mg/mL)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	62248	핵 염색
다이아몬드 나이프 No. 88 CM	일반 도구	31116
에탄올	팜코	111000200
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 0.5 m	폭스바겐	BDH7830-1
FFPE 신장 샘플	USB아이오맥스	휴FPT072
집게
마이크로 커버 유리 #1 (24 mm x 60 mm)	폭스바겐	48393 106
마이크로 커버 유리 #1.5 (24 mm x 60 mm)	폭스바겐	48393 251
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)	시그마 알드리치	T9281	가속기
N,N'-메틸렌비스아크릴아미드	시그마 알드리치	M7279
Nunclon 6-Well 세포 배양 접시	써모 피셔	140675
Nunc 15 mL 원뿔형	써모 피셔	339651
Nunc 50 mL 원뿔형	써모 피셔	339653
오비탈 셰이커
페인트 브러시
pH 측정기
인산염 완충 식염수(PBS) 10x 용액	피셔 사이언티FC	BP399-1
플라스틱 페트리 접시 (100mm)	피셔 사이언티FC	FB0875713
Proteinase K (분자생물학 등급)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	EO0491
면도날	피셔 사이언티FC	12640
Safelock 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL	써모 피셔	3457
Safelock 마이크로 원심분리기 튜브 2.0 mL	써모 피셔	3459
아크릴산 나트륨	시그마 알드리치	제408220
소금	시그마 알드리치	S6191
구연산나트륨 tribasic dihydrate	시그마 알드리치	C8532-1KG
트리스 베이스	피셔 사이언티FC	BP152-1
트리톤 X-100	시그마 알드리치	T8787
크실렌	시그마 알드리치	214736