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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 새로운 수술 절차를 통해 유체 이미징 컬럼 아래의 신장에 대한 측면 피펫 접근
참고: 이미징 지원 시스템 및 수술 준비의 어셈블리는 그림 1에 나와 있습니다. 설명된 절차는 무게가 20–25g인 C57BL/6 마우스에서 수행됩니다.
- 마우스의 무게를 잰다.
- 4% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도하고 공기/산소 혼합물에서 1.5–2.5% 이소플루란으로 유지합니다. 마우스가 고통스러운 자극에 대한 반응이 없고 호흡수가 감소하여 마취되었는지 확인합니다.
- 눈에 윤활유를 바르고 동물을 베이스 플레이트의 측면에 배치합니다. 테이프를 사용하여 4개의 사지를 고정합니다.
- 생리식염수 200μL를 피하주사하고 직장 온도 프로브를 놓습니다. 수술 중에는 히팅 램프를 사용하여 온도를 조절하고 이미징 중에는 히팅 패드를 사용하여 온도를 조절합니다.
- 제모 크림을 사용하여 마우스 왼쪽의 모든 털을 제거합니다.
- 피부 아래에서 볼 수 있는 비장을 찾고, 비장의 등쪽과 꼬리쪽에 있는 왼쪽 신장을 찾습니다.
- 피부를 0.5cm 정도 절개하고 복막을 더 작게 절개하여 신장이 쉽게 통과할 수 있을 정도
로만 절개합니다.
- 부드러운 압력으로 신장을 돌출시킵니다. 폴리실록산으로 만든 신장 안정제 형태를 신장 주위에 놓고 시아노아크릴레이트 접착제로 고정합니다. 신장의 가장 측면 표면이 안정기 너머로 약 1mm 확장되도록 신장을 스페이서와 정렬합니다.
- 접착제로 헤드 플레이트를 안정기 형태로 고정하고 헤드 플레이트를 베이스 플레이트의 마운팅 바에 장착합니다.
- 신장을 둘러싼 폴리실록산 지지대의 웰을 1% 아가로스 용액으로 채우고 10mm 커버슬립을 위에 놓고 아가로스가 단단해질 때까지 유지합니다. 커버슬립을 접착제로 헤드 플레이트에 밀봉하고 치과용 시멘트로 커버슬립 주위에 링을 만듭니다.
- FITC-dextran(2,000,000Da, 5% 용액, 100–150μL)을 역궤도로 주입하고 마우스와 고정 플레이트를 2광자 현미경 스테이지로 빠르게 이동하여 마취를 유지하고 현미경 스테이지에서 적절한 폐가스 청소를 보장합니다.
2. Bowman의 공간에 대한 적절한 사구체 및 피펫 접근 선택
- 정의:
- X를 화면에서 왼쪽-오른쪽으로, 현미경을 향하는 왼쪽-오른쪽으로 정의합니다.
- 스테이지 컨트롤러에서 SX(스테이지 X) 읽기
- 파이펫 다이얼 컨트롤러에서 PX를 파이펫 X로 정의합니다.
- Y를 화면에서 위-아래로, 현미경 쪽으로 앞으로 그리고 다시 2-광자 설정 쪽으로 정의합니다
.
- Z를 천장을 향해 위쪽, 바닥을 향해 아래쪽으로 정의하며 목표 Z 위치로 스테이지에서 측정합니다.
- S(O)Z를 스테이지(실제로 목표) 높이로 정의합니다.
- 안구에서 녹색 형광 단백질(GFP) 필터 설정을 사용하여 식별할 수 있는 신장 표면을 찾습니다. FITC-Dextran의 주입으로 인해 혈관 구조는 밝은 녹색이 됩니다.
- 적절한 사구체를 식별합니다. 안구를 사용하여 신장 표면을 식별한 후 2-광자(비스캔 모드)로 전환하고 이미징 창을 탐색합니다. 미세 천자에 유리한 특성은 다음과 같습니다 : 커버 슬립 아래의 수직 거리 > 30 μm (접근 중 피펫과 커버 슬립 사이의 충돌을 방지하기 위해) 및 측면 신장 캡슐에서 사구체까지의 측면 거리 <400 μm (이 거리를 초과하면 피펫의 편차가 누락 가능성을 증가시킬 수 있음).
- 천자 지점, 즉 신낭의 한 지점에서 사구체의 피펫 쪽까지 수평 및 수직 거리를 기록합니다.
- 객관적인 초점을 물기둥으로 올리고 x 및 y 스테이지 좌표를 약 1센티미터만 변경하지 않고 유지합니다.
- 피펫 팁을 물기둥에 밀어 넣고 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) excitation을 켭니다. x 및 y 치수의 피펫을 팁의 최대 형광 지점으로 이동하면 이것이 대물렌즈의 중심이 됩니다. 이러한 정확한 전위치 지정 없이는 안구에서 피펫을 찾기가 어렵습니다. 양자점은 여기 파장에 관계없이 동일한(이 경우 빨간색) 파장에서 형광을 발하기 때문에 DAPI 여기는 그림 2와 같이 팁에 단단히 초점을 맞춘 적색 형광을 생성합니다.
- excitation 설정을 red fluorescent protein(RFP)으로 변경하고 안구에서 피펫을 시각화한 다음 안구 보기에서 정확하게 중앙에 배치합니다.
- 2-광자로 전환하고 2-광자 아래에서 피펫을 찾아 이미지 중앙에 정확하게 배치합니다. 이것은 등록 직위입니다.
- 피펫의 이미지를 저장합니다.
- 스테이지와 마이크로피펫 컨트롤러 좌표를 등록합니다.
메모: JavaScript 코드(스프레드시트 소프트웨어가 설치되지 않은 시스템에 유리함) 또는 스프레드시트를 사용하여 계산을 실행하는 보조 .html 파일을 사용하여 스테이지와 파이펫 좌표 사이의 오프셋을 계산하고 파이펫 컨트롤러의 목표 좌표를 계산합니다.
- z와 y를 동일하게 유지하면서 x축의 물기둥에서 피펫을 제거합니다.
- 피펫 Z를 표적 사구체 Z로 이동합니다(즉, 피펫을 커버슬립 아래의 Z 방향으로 아래로 이동).
- 피펫 Y를 대상 사구체 Y 좌표로 이동합니다.
- 2-광자 라이브 뷰를 대상 사구체 Z로 이동한 다음 신장 가장자리로 이동하고 SX를 확인합니다.
- 정합 SX의 오프셋을 사용하여 신장 가장자리 PX를 계산합니다.
- 스테이지를 피펫 쪽으로 이동하여(SX 증가) 신장의 가장자리가 화면의 맨 왼쪽에 있지만 여전히 보이도록 합니다.
- 위에서 계산한 신장 가장자리 PX보다 약 100μm 낮게 피펫을 빠르게 전진시킵니다.
- 피펫 팁을 찾아 피펫을 천천히 전진시킵니다. 적색 게인을 높이고 적색 픽셀 히스토그램을 관찰합니다(양자점의 극단적인 밝기와 off-target 형광으로 인해 피펫이 창에서 이미지화되기 전에 픽셀 분포가 이동함).
- 라이브 2-광자 이미징에서 신장 가장자리로 이동합니다.
메모: 신낭에 들어가기 전에 Y 및 Z 차원에서 피펫의 방향을 바꿀 수 있습니다. 그러나 이로 인해 피펫 팁이 파손될 수 있습니다. 피펫이 목표에서 벗어난 경우 보다 보수적인 조치는 X 차원에서 최대 2cm까지 빼내고 방향을 바꾼 다음 X 차원에서 신장 가장자리로 되돌리는 것입니다. 일단 피펫이 조직 내에 있게 되면, X 이외의 축으로의 움직임은 피펫 굴곡으로 이어지며, 이는 활용하기 위해 많은 경험이 필요하며 종종 파손으로 이어집니다.
- SX를 주시하면서 X축의 파이펫을 glom 대상 PX까지 천천히 구동합니다. (때때로 사구체로 돌아가서 마이크로피펫을 삽입할 때 사구체가 전혀 이동했는지 확인하는 것이 도움이 됩니다.)
- 올바른 위치에 있으면 z-stack.
사용하여 위치를 문서화합니다.
메모: 마이크로피펫을 장착한 상태에서 약물, 단백질 또는 형광 추적자를 주입하거나, 추후 분석을 위해 유체를 흡인하거나, 다른 전극에 대한 압력 또는 전하를 측정할 수 있습니다.
3. Bowman의 공간에서 유체의 열망
- 100분에 걸쳐 2nL의 퍼플루오로데칼린을 주입하도록 마이크로 펌프를 설정하여 피펫의 개통성을 보장하고 진입 중 피펫 막힘으로 인한 혼란을 줄입니다. 파이펫 위치를 보장하기 위해 이미지를 다시 설치합니다.
- 추가 여과를 위해 4-6분 정도 기다립니다.
- 최대 300nL/min.
의 속도로 최대 50nL까지 흡입하도록 마이크로 펌프를 설정합니다.
메모: 사구체 형태의 변화는 이 비율로 관찰되지 않으며, 이는 흡인 중 공간으로의 유체 전달 속도에 변화가 없음을 시사합니다. 기존의 미세 천공과 같이 오일 블록이 없기 때문에 질량 분석에 필요한 이 부피의 회수에는 주입된 과불소데카린 중 일부와 튜브형 유체가 포함될 수 있습니다. 이온에 민감한 전극 측정, 형광 분광법, 중합효소 연쇄 반응 및 기타 민감한 종말점과 같은 분석의 경우 더 적은 부피가 사용될 수 있습니다. 질량 분석법이 종말점이 아닌 경우 미네랄 오일과 표준 미세 천공 기술을 사용하여 보관 전에 흡입량을 측정할 수 있습니다.
- 이미지를 한 번 더.
- 피펫을 회수하고 샘플을 보존하고 TRIS 완충액을 추가하고 분석 전에 -80°에서 보관합니다.
- 이소플루란의 과다 복용 또는 기타 승인된 방법을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
메모: 여과액은 사구체 모세혈관에서 여과를 통해 공간으로 들어갑니다. 마우스의 단일 네프론 사구체 여과율(SNGFR)은 8-14nL/min 사이에서 보고됩니다. 그러나 Starling 힘이 SNGRF을 지배하고 Bowman의 공간에서 음의 정수압이 SNGRF을 증가시킬 수 있습니다. 표준 미세 천공 방법은 관형 유체 샘플링을 위해 오일과 중성압으로 관형 차단을 사용하지만 이러한 화합물은 질량 분석을 방해합니다(아래 참조). 그러므로, 이 기술에서 초기 근위세뇨관은 특허로 남아 있습니다. 또한, 흡인 당시 Bowman의 공간에는 알려지지 않았지만 양의 여과액이 포함되어 있습니다. 따라서 유체 흡입 속도는 SNGFR.
를 초과할 수 있습니다.
메모: 여기에 설명된 실험에서 목표는 나노 단백질체학 기술에 의한 질량 분석 분석을 위해 평소보다 큰 사구체 여과액 샘플을 얻는 것이었습니다. 질량 분석법을 사용하면 미네랄 오일 또는 왁스(신호 : 질량 분석에서 노이즈를 감소시키는 유기 분자의 복잡한 혼합물)와 함께 오일 블록을 사용할 수 없기 때문에 perfluorodecalin을 사용하여 마이크로 피펫과 주사기를 채 웁니다. Perflourodecalin은 세뇨관 흐름을 차단하는 것으로 알려져 있지 않지만 생물학적으로 불활성이며 질량 분석을 방해하지 않습니다.
