닭 CAM에 대한 신장 유기형 배양: 신장 혈관 구조의 형성을 유도하기 위해 닭 CAM에 쥐 신장 이식 기술

초록

출처: Kaisto, S. et al. 혈관화, 발달 연장 및 현미경 이미징 개선을 위한 신장 오가노이드 및 유기형 배양 최적화. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 조류 배아의 융모막막막(CAM)에 대한 개선된 이종 이식 설정을 사용하여 장기 발달을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 완전히 혈관화된 배양 배아 기관 및 오가노이드의 발달을 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. 닭 CAM에서 마우스 배아 신장 및 신장 오가노이드 배양을 위한 Minireservoirs 제작 및 이종 이식 실험 설정

1. 6웰 또는 12웰 플레이트용으로 설계된 트랜스웰 세포 배양 인서트를 사용합니다.
   메모: 특정 실험에 따라 크거나 작은 미니 저장소를 사용할 수 있습니다. 최대 8개의 배아 신장을 이종 이식하거나 동일한 닭 배아에 여러 개의 미니 저장소를 배치할 경우(예: 동일한 닭 CAM에서 실험 및 대조군 샘플)를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
2. 원형 톱날이 있는 회전식 멀티툴 또는 핸드 톱을 사용하여 인서트의 측면을 잘라 투과성 멤브레인이 부착된 2mm 높이의 플라스틱 링을 만듭니다.
3. 이 미니 저장소의 가장자리를 메스나 날카로운 칼로 닦으십시오.
4. 미니 저장소를 70% 에탄올로 최소 1시간 동안 살균합니다.
5. 미니 저장소를 오토클레이브 이중 증류수로 세척하고 층류 후드에서 건조시킵니다.
6. PBS와 배양 배지(고포도당 DMEM/10% FBS/1% 페니실린-스트렙토마이신)로 minireservoir를 헹굽니다.
7. 멤브레인이 위를 향하도록 한 방울(600 μL/400 μL)의 배양 배지 위에 있는 페트리 접시에 저장소를 놓습니다.
8. 절개된 생체 외 배아 신장 또는 신장 오가노이드를 피펫 또는 유리 모세관 튜브를 사용하여 멤브레인에 고르게 배열합니다. 신장 주변에 많은 액체를 남기지 마십시오.
9. 샘플을 37°C 및 5% CO₂.
   의 세포 배양 인큐베이터에서 2-24시간 동안 멤브레인에 부착합니다. 메모: 최대 8개의 E11.5 배아 마우스 신장 또는 신장 오가노이드를 작은 인서트에 배치할 수 있습니다. 이종 이식에 더 큰 배아 조직 조각을 사용하거나 CAM의 더 넓은 영역에 세포-하이드로겔 혼합물을 사용하는 경우 큰 삽입물을 사용하는 것이 좋습니다.
10. 이전에 발표된 방법에 따라 준비된 8일 된 배아 배양 닭을 세포 배양 인큐베이터에서 꺼냅니다.
11. 미니 저장소를 CAM으로 전송하여 이식편이 CAM을 향하고 멤브레인이 이를 오버레이하도록 합니다. 미니 저장소가 닭 배아를 덮지 않도록 CAM 주변에 놓습니다.
    메모: 12웰 플레이트용 트랜스웰 인서트로 제작된 더 작은 미니 저장소를 사용하는 경우 하나의 CAM에 최대 3개의 미니 저장소를 배치할 수 있습니다.
12. 500 μL(6웰 인서트) 또는 300 μL(12웰 인서트)의 배양 배지를 minireservoir에 추가합니다.
13. 최대 9일 동안 닭 CAM에서 샘플을 배양합니다. 미니 저장소의 배양 배지를 매일 교체하십시오.
    메모: 샘플의 혈관 형성은 이식 후 24-48시간 이내에 관찰할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양기	파나소닉	13090543	온도 37°C, 습도 90%, CO₂ 5%로 설정
세포 배양기	산요	10070347	치킨 CAM 배양 인큐베이터. 온도 37°C, 습도 90%, CO₂ 5%로 설정
둘베코의 변형된 독수리의 매체	시그마	D777	높은 포도당
에탄올 (70%)	폭스바겐
소 태아 세럼	하이클론	SH3007003HI 써모 사이언티픽
겸자 DUMONT #5	뒤몽	#5SF
PBS -/-	코 닝	20-031-이력서
PBS +/-	바이오웨스트	X0520-500	미니 저수지 세척.
페니실린과 스트렙토마이신	시그마	P4333
0.4μm 공극 폴리스티렌 멤브레인을 사용한 Thincert 12웰 세포 배양 인서트	Greiner 바이오 원	665641
0.4μm 공극 폴리스티렌 멤브레인을 사용한 Thincert 6웰 세포 배양 인서트	Greiner 바이오 원	657610