외과적 수조 마그나 주사: 쥐 모델의 중추 신경계에 종양 세포를 직접 투여하는 방법

초록

출처: Law, V. et al. 연수막병의 직접 표적 치료를 연구하기 위한 쥐 ommaya 이종 이식 모델. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 인간 유래 종양 세포를 쥐 뇌의 수조 마그나로 전달하는 절차를 설명합니다. 정소성 마우스 모델은 두개골 수막으로의 암의 전이성 확산을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. CTC 준비

1. 주입에 필요한 CTC 수를 계산하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에서 1.0 ×^{10 4} cells/μL의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 절차 내내 세포 현탁액을 얼음 위 또는 4°C에 놓습니다.
   메모: 트립신화가 필요한 세포주를 사용하는 경우 반드시 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척하여 트립신을 제거해야 합니다. 혈구계(hemocyometer) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 대규모 코호트(>50 마우스)를 사용하는 경우, 세포를 다시 세고 주입 사이에 세포 생존력을 검증하여 마우스당 일관된 수의 세포가 투여되도록 합니다.

2. 수술 전 절차

1. 마우스에 5mg/kg 부프레노르핀 서방형(Bup-SR)을 피하주사합니다.
   메모: 제안된 절개 부위를 주입하지 마십시오. 견갑골에서 멀리 떨어진 주사 부위를 선택하십시오.
2. 마우스 2-3% 이소플루란으로 마우스 마취를 하면 오른쪽 반사 징후가 나타나지 않을 때까지 마취합니다. 또한 꼬리 및/또는 발 꼬집음 반사를 확인하여 마취 상태를 확인합니다.
3. 수술 장소에서 멀리 떨어진 위치에서 수술을 위해 마우스를 준비합니다. 털이 절개 부위를 오염시키지 않도록 충분한 경계 영역으로 수술 부위(즉, 두개골의 등쪽 표면)를 클립합니다. 그런 다음 살균 피부 소독제로 부위를 적셔 부위 중앙에서 주변부로 작업 한 다음 건조시킵니다. 멸균 드레이프 또는 멸균 접착제 뒷면의 플라스틱 드레이프 소재를 적용하여 수술 부위를 오염으로부터 보호하십시오.
   메모: 기구는 사전에 고압멸균해야 하며, 팁은 유리 구슬 살균기를 사용하여 동물 간에 재멸균해야 한다.
4. 머리의 전체 복부 표면의 털을 면도하고 멸균 기술을 사용하여 피부를 준비합니다.
5. 정위 장치의 수정된 L자형 노즈콘으로 코를 위치시켜 콧구멍이 깨끗하고 열린 상태로 유지되도록 합니다. 양쪽 귓바퀴의 복부 표면을 테이프로 가로질러 피부를 부드럽게 앞으로 당겨 콧방울에 고정하고 고정되면 목을 약 90° 각도로 구부립니다. 마취를 유지하기 위해 1.5% 이소플루란을 투여합니다.
   메모: 적절한 위치를 잡으면 후두골의 꼬리 융기를 쉽게 식별할 수 있는 방식으로 절개 부위가 표시됩니다.
6. 척추가 수조 마그나와 수평을 유지하도록 몸을 배치하고 꼬리에 약간의 견인을 가하면서 꼬리 바닥에 테이프를 붙여 고정합니다.

3. 외과 용 수조 마그나 주입

1. 목을 완전히 펴고 귓바퀴 바로 사이부터 시작하여 후두골을 가로질러 약간의 압력으로 수술용 가위끝을 아래로 움직입니다.
   메모: 이 정중선 위치에 있는 동안 가위 끝이 수조 마그나 위의 오목한 부분으로 들어갈 때 작은 함몰이 눈에 띕니다.
2. 촉진된 오목한 부분 바로 위에 3-5mm의 작은 정중선 절개를 만듭니다. 1.0 × 10⁴ cells/μL(총 5.0 × 10⁴ 셀)에서 5 μL의 세포 현탁액을 30 G Hamilton 주사기에 주입합니다.
3. 끝이 뭉툭한 집게와 1-2mm 끝이 뭉툭한 집게를 사용하여 수조 마그나를 부드럽게 누릅니다. 닫힌 위치에 팁을 삽입하고 경막에 아래쪽 압력을 가하면서 엽니다.
4. 경막이 쉽게 식별되고 노출된 영역에서 관련 혈관이 보일 때까지 이전 단계에서 설명한 둔기 박리를 반복합니다.
   메모: 그 결과로 생긴 주입 창은 바늘 삽입 중에 혈관이 손상되지 않도록 합니다.
5. 집게를 열어 주변 근육 조직을 수축시킨 상태에서 경막 아래에 30G의 코어를 주지 않는 바늘을 삽입하여 베벨을 시각화합니다. 바늘이 베벨 바로 너머로만 삽입되도록 합니다. 주사기 플런저를 천천히 펴서 경막 바로 아래에 세포를 전달합니다.
6. 경막 아래의 주입을 관찰하기 위해 베벨을 적절하게 배치하십시오. 이 기술을 신중하게 투여하고 30G 비코어링 바늘을 사용하여 멤브레인 손상을 방지하고 누출을 최소화합니다. 누출이 감지되면 솜 끝이 있는 애플리케이터로 부드러운 압력을 가하십시오.
7. 상처 클립이나 피부 접착제를 마이크로 드롭하여 피부를 봉합합니다. 주사가 성공적으로 수행되면 마우스가 따뜻한 담요에서 마취에서 회복되도록 하고 흉골 위치를 유지하고 의도적인 움직임을 보여줄 수 있을 때까지 계속 관찰합니다.
8. 첫 주 동안 수술 후 매일 마우스를 모니터링하십시오. 마우스가 통증이나 괴로움을 느끼는 것 같으면 수의사의 상담 및 지시에 따라 최대 5일 동안 12-24시간에 한 번씩 10mg/kg의 카프로펜 피하 주사로 치료합니다. 다음 단계를 진행하기 전에 마우스가 최소 48-72시간 동안 회복하고 모니터링할 수 있도록 합니다.
   메모: Bup-SR은 선제적으로 투여하면 최대 72시간 동안 지속되므로 일반적으로 추가 진통제가 필요하지 않습니다. 그러나 필요에 따라 동물에게 추가 진통제가 제공됩니다(무기력한 경우, 먹지 않는 경우, 주름진 경우). 수술 부위에 수술 후 감염 징후(예: 발적, 부기, 압통, 이질통, 통각 과민, 과민증 또는 화농)가 나타나거나 마우스가 해당 부위를 보호하고 있는 경우 마우스를 안락사시킵니다. 암세포가 CSF에 성공적으로 주입되면 1주 또는 2주 이내에 중추신경계에서 LMD 및 종양 진행이 진행됩니다(CTC 유형 또는 사용된 세포주에 따라 다름)(그림 1).

결과

그림 1: 연수막 질환 및 중추신경계 전이를 연구하기 위한 쥐 이종 이식 모델에서 순환 종양 세포를 수조 마그나에 주입.(A) 수조 마그나의 위치와 CSF 접근 부위를 보여주는 그림으로, CTC가 해밀턴 주사기를 사용하여 주입됩니다. (B) 순환 종양 세포를 2주 동안 주입한 후 연수막 질환 및 중추 신경계 전이(뇌 및 척수를 따라)가 발생한 마우스의 대표적인 IVIS 이미지. 세포는 루시퍼라제 리포터 유전자로 표지되었습니다. 식염수를 주입한 대조군은 종양이 발생하지 않았으며(n=3), 실험은 3회씩 진행되었다. 약어: CTCs = 순환 종양 세포; IVIS = 생체 내 이미징 시스템.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
비드 살균기	Braintree Scientific Inc.(또는 모든 공급업체)	#GER 5287-120V	저미네이터 500
부프레노르핀 서방형(Bup-SR)	주팜		DEA 통제
Hamilton 마이크로리터 주사기	해밀턴		10, 25, 50 및 100 μL; 수조 마그나 주입을 위한 30G
인산염 완충 식염수(PBS)	모든 공급업체		0.1mm 멸균 필터
설치류 수술 기구(가위, 집게)	Roboz 수술 기구(또는 모든 공급업체)
멸균 블루 페이퍼/드레이프 커버	모든 공급업체
멸균 코튼 스틱	모든 공급업체