쥐의 Intracerebroventricular Injection: 마우스 뇌의 뇌실에 약물을 전달하기 위한 Ommaya 매개 직접 약물 투여 방법

초록

출처: Law, V. et al. 연수막 질환의 직접 표적 치료를 연구하기 위한 쥐 옴마야 이종 이식 모델. J. Vis. 특급. (2021년)

이 비디오는 마우스 모델에서 옴마야 매개 뇌실 내 주사를 보여줍니다. 이 방법은 잠재적인 약물 후보의 국소 전달을 가능하게 하고 혈액-뇌 장벽을 회피합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Murine Ommaya 조립 및 이식

1. 스테이션의 준비
   1. 스테이션 표면을 소독하십시오. 표면에 파란색 덮개를 씌우고 그림 1에 표시된 모든 멸균 도구와 소모품을 준비하십시오.
2. 수술 전 절차
   1. 진통제(Bup-SR)를 도포하고 무균 수술 환경을 유지합니다.
3. Murine Ommaya의 외과적 이식
   1. 25G(외경 0.51mm) 소형 주입 포트와 1mm 스페이서 디스크를 사용하여 Murine Ommaya 주입 장치를 조립합니다. 시아노아크릴레이트 멸균 접착제를 사용하여 약 2.5mm의 금속 캐뉼라가 오른쪽 대뇌 반구로 침투하도록 합니다(그림 2A–C).
      메모: 이 실험실에서는 MRI 호환 Mouse Ommaya 프로토타입이 개발되었으며, 이미 두 부품(소형 주입구 및 스페이서)이 단일 장치로 3D 프린팅되어 있습니다(그림 2D). 단일 장치 버전은 MRI로 테스트되었으며 조립 단계를 제거하여 시간을 절약할 수 있습니다.
   2. 오른쪽 반사의 징후가 없을 때까지 2-3% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 또한 꼬리 및/또는 발 꼬집 반사를 확인하여 마취 상태를 확인합니다.
   3. 털 머리의 복부 표면 전체를 면도하고 멸균 기술에 따라 피부를 준비하십시오. 콧방울이 있는 정위 장치에 마우스를 놓고 절차 중에 이소플루란 투여를 계속합니다. 이소플루란을 1.5%로 줄입니다. 이어바를 부드럽게 조여 머리를 고정하고 눈 윤활제를 바르면 마우스의 눈을 덮습니다.
   4. 작은 피부 절개(3mm)를 한 다음 아래에 있는 피하 조직을 둔기로 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 과산화수소에 적신 솜 팁 어플리케이터 스틱을 사용하여 두개골을 말리십시오.
   두개골의
   5. 뒤쪽 0.5mm, 측면 1.1mm의 버 구멍을 뚫습니다(코로나 봉합사가 시상 봉합사에 의해 수직으로 교차하는 두개골의 해부학적 지점)(그림 2A), 경막을 노출시키기 위해 0.9mm의 버 구멍을 뚫습니다. 마이크로드릴을 옆으로 치우고 시아노아크릴레이트 멸균 접착제를 사용하여 두개골에 부착된 주입구(깊이 약 2.5mm)를 삽입하기 전에 버 구멍 바로 주위의 뼈를 부드럽게 긁습니다. 중단된 스티치 패턴 또는 지갑 끈 봉합사에서 4-0 무흡absorbance 나일론 봉합사를 사용하여 주입 부위 주위를 봉합합니다.
   6. 수술 후 생쥐를 수술 회복을 위해 개별 케이지에 수용합니다.
      메모: 수술로 회복된 여러 마리의 쥐가 같은 케이지에 있을 때 Murine Ommaya가 벗겨질 수 있는데, 이는 아마도 지속적인 조작 상호 작용으로 인한 것일 수 있습니다. Murine Ommaya에 이식된 마우스는 약물 효능 시험 기간 동안 개별적으로(또는 케이지당 2마리 이하) 수용하는 것이 좋습니다.

2. 뮤린 옴마야 트리트먼트

1. Murine Ommaya를 사용한 마우스 투여
   1. 바로잡는 반사의 징후가 없을 때까지 2-3% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 또한 꼬리 및/또는 발 꼬집 반사를 확인하여 마취 상태를 확인합니다.
   2. Murine Ommaya는 포트 주입 어댑터와 Hamilton 주사기를 사용하여 접근합니다. 집게를 사용하여 소형 주입 포트의 상단을 잡고 포트 주입기 어댑터를 포트의 셉텀에 완전히 부드럽게 삽입합니다.
      메모: 포트 인젝터는 데드 스페이스를 최소화하고 전동 주사기 펌프를 통해 제어된 주입을 허용하는 방식으로 포트의 격막을 관통합니다(그림 3A). 표적/새로운 치료법은 마취 상태에서 1μL/분의 유속으로 주입됩니다. 치료는 연구자의 재량에 따라 정해진 기간(주/월) 동안 지정된 간격(매일/매주)으로 투여되어야 합니다.
      3 <3 μL의 부피는 신뢰할 수 없고 >7 μL의 부피는 너무 많은 압력을 유발할 수 있으므로 3 및 7 μL 사이의 부피가 최적입니다. Hamilton 주사기의 크기는 각 치료군의 마우스 수에 따라 10 - 100 μL까지 다양할 수 있습니다. Hamilton 주사기에 적절한 부피를 미리 로드하면 주사기의 반복적인 교체를 방지할 수 있어 오류를 최소화할 수 있습니다. 트리트먼트 암당 1개의 해밀턴 주사기를 전용으로 사용하는 것이 가장 좋습니다.
   3. 주사가 이루어지면 집게를 사용하여 포트 주입 어댑터에서 Murine Ommaya를 분리하고 마우스를 케이지로 다시 가져와 마취에서 회복합니다.

결과

그림 1: 마우스에 Murine Ommaya 이식을 수행하기 위한 워크스테이션 설정의 예. (1) 가스 마취기/기화기. (2) 입체 스탠드를 덮고있는 멸균 된 파란색 종이 드레이프. (3) 입체 장치(스탠드/스테이지, 이어바, 노즈 콘). (4) 마이크로 드릴. (5) 빛으로 돋보기. (6) 멸균 식염수 헹굼 용기가 있는 멸균 면팁 어플리케이터 스틱. (7) 과산화수소. (8) 비드 살균기.

그림 2: Murine Ommaya 장치의 이식.(A) 두개골의 브레그마 위치를 가리키는 화살표와 마이크로 드릴을 사용하여 브레그마에서 두개골(후방 0.5mm/측면 1.1mm)에 버 구멍을 뚫는 대략적인 거리. (B) Murine O...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mm 스페이서 디스크	알제, 듀렉트 코퍼레이션	#0008670	스페이서 디스크만 해당
4-0 에틸론 나일론 봉합사	모든 공급업체
자동 주사기 펌프	Harvard Syringe Pumps(또는 모든 공급업체)	#70-4505	펌프 11 엘리트
비드 살균기	Braintree Scientific Inc.(또는 모든 공급업체)	#GER 5287-120V	저미네이터 500
부프레노르핀 서방형(Bup-SR)	주팜		DEA 통제
시아노아크릴레이트 멸균 접착제	모든 공급업체
가스 흡입 아네스테시아 시스템	베트이핍	#901812	COMPAC5
Hamilton 마이크로리터 주사기	해밀턴		10, 25, 50 및 100 μL; 수조 마그나 주입을 위한 30G
과산화수소	모든 공급업체
IVIS 200 이미징 시스템	캘리퍼 생명 과학
빛을 사용한 돋보기	모든 공급업체
마이크로드릴	스톨팅(또는 모든 공급업체)	#51555M
MRI 영상	브루커	BioSpec 시리즈	선택적
Murine Ommaya (MRI 호환) 프로토 타입	인스텍 연구소, Inc.	#VAB620-25MRI-3.3
PinPort 인젝터	인스텍 연구소, Inc.	#PNP3M-50
핀포트	인스텍 연구소, Inc.	#1-PNP3F28-50
설치류 수술 기구(가위, 집게)	Roboz 수술 기구(또는 모든 공급업체)
입체택시 장치	스톨팅(또는 모든 공급업체)	#51730M
멸균 블루 페이퍼/드레이프 커버	모든 공급업체
멸균 코튼 스틱	모든 공급업체