세포 생물 발광 기반 분석법: 조합 약물 스크리닝을 위한 고처리량 방법

Abstract

출처: Hu, Z. et al. 환자 유래 신경교종 줄기세포를 사용하여 교모세포종에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하기 위한 신속한 스크리닝 워크플로우.J. Vis. 특급(2021년)

이 비디오에서는 약물의 민감하고 신속한 스크리닝을 위한 생물 발광 분석의 유용성을 강조하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 약물은 단독으로 또는 조합하여 작용 방식의 시너지 효과를 평가할 수 있습니다.

Protocol

1. 세포 생존율의 생물 발광 기반 측정

1. 세포외 기질(ECM) 혼합물(예: Matrigel)로 플레이트 코팅: 각 웰에 40μL의 0.15mg/mL ECM 혼합물을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 여분의 ECM 혼합물을 제거하고 PBS로 한 번 부드럽게 헹굽니다.
2. 15,000, 10,000, 8,000, 6,000, 4,000, 2,000, 1,000 및 500 XG387-Luc 세포를 포함하는 100 μL 배양 배지를 96-well 광학 바닥 플레이트에서 6회 복제를 위해 각 웰에 대조군으로 첨가하고 37°C에서 밤새 세포를 배양합니다.
3. 상층액을 제거하고 150ng/μL D-루시페린을 함유한 50μL 배양 배지를 각 웰에 첨가한 후 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
4. IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 플레이트의 세포 생체 발광 이미지를 촬영합니다. 내장 소프트웨어를 사용하여 관심 영역(ROI)의 여러 원형 영역을 생성하고 세포 생체 발광을 정량화할 수 있습니다.

2. 테모졸로마이드 치료 및 조합 스크리닝

1. 처리 전에 1단계에서 위에서 설명한 대로 4개의 96웰 플레이트를 사전 코팅합니다.
2. 100μL 배양 배지에 1,000개 세포 밀도의 XG387-Luc 세포를 96웰 광학 바닥 플레이트의 각 웰에 시딩하고 밤새 세포를 배양합니다.
3. 원액에서 테모졸로마이드와 표적 제제를 미리 준비합니다. 단일 제제 처리를 위해 배양 배지에서 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM 및 50 μM 테모졸로아미드로 구성된 농도 시리즈를 준비합니다. 테모졸로마이드와 표적 제제를 각각 배양 배지의 원액에 희석하여 조합 약물 스크리닝을 위한 200μM 및 2μM의 최종 농도를 얻습니다(재료 목록).
4. 대부분의 GSC가 플레이트의 바닥에 부착 될 때 배양 배지를 제거하십시오. 테 모졸로 마이드를 함유 한 위에서 제조 된 배지를 각 웰에 추가하여 처리 당 3 번의 기술적 인 복제를 수행합니다.
5. 테모졸로마이드를 치료하고 약물 조합을 스크리닝하기 위해 빈 배지를 제거하고 200μM 테모졸로마이드 또는 2μM 표적 제제 또는 이 둘의 조합을 포함하는 위에서 준비한 배지를 각 웰에 첨가하여 처리당 3회의 기술적 반복을 수행합니다.
6. 모든 플레이트를 37 ° C, 5 % CO₂에서 3 일 동안 배양합니다.
7. 약물 함유 배지를 제거하고 150ng/μL D-루시페린을 함유한 50μL 블랭크 배지를 각 웰에 첨가하고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
8. IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 플레이트의 세포 생체 발광 이미지를 촬영합니다. 내장 소프트웨어를 사용하여 여러 개의 원형 ROI를 생성하고 세포 생체 발광을 정량화할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
나-27	지브코	제17504-044	50배
증권 시세	지브코	PHG0313	20 ng / ml
증권 시세	지브코	PHG0263	20 ng / ml
글루타 맥스	지브코	35050061	100배
뉴로기저	지브코	21103049	1배
페니실린-스트렙토마이신	하이클론	SV30010	P: 10,000개/mlS: 10,000ug/ml
나트륨 피루브산	지브코	2088876	100 밀리미터미터
737	증권 시세		선택적 및 BH3 모방 Bcl-2 Bcl-xL 및 Bclw 억제제
아다보세르티브 (MK-1775)	증권 시세		Wee1 억제제
액시티닙	증권 시세		다중 표적 티로신 키나아제 억제제
AZD5991	증권 시세		Mcl-1 억제제
아 83-01	증권 시세		TGF-β형 I 수용체 ALK5 키나아제의 강력한 억제제
CGP57380	셀렉		강력한 MNK1 억제제
닥톨리십(BEZ235)	셀렉		듀얼 ATP경쟁적 PI3K 및 mTOR 억제제
다사티닙	증권 시세		이중 Bcr-Abl 및 Src 계열 티로신 키나아제 억제제
엘로티닙	증권 시세		EGFR 티로신 키나아제 억제제
게피티닙	증권 시세		EGFR 티로신 키나아제 억제제
리니파닙	증권 시세		VEGFR 및 PDGFR 계열의 다중 표적 억제제
마시티닙	증권 시세		c-Kit 억제제
ML141	셀렉		Cdc42 GTPase의 비경쟁적 억제제
OSI-930	증권 시세		Kit, KDR 및 CSF-1R의 다중 표적 억제제
팔보시클리브	증권 시세		선택적 CDK4 및 CDK6 억제제
SB 202190	증권 시세		선택적 p38 MAP 키나아제 억제제
세판트로늄 브로마이드(YM-155)	증권 시세		생존 억제제
TCS 359	셀렉		강력한 FLT3 억제제
유미-77	증권 시세		선택적 Mcl-1 억제제
4-하이드록시타목시펜(아피목시펜)	셀렉		선택적 에스트로겐 수용체(ER) 조절제