SDS-PAGE 기반 세포 외 소포 관련 단백질 추출: EV에서 단백질을 추출하고 겔 내 분해를 위해 준비하는 절차

초록

출처: Lemaire, Q. et al. 면역 세포 유래 세포외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오에서는 세포외 소포체 또는 EV에서 단백질을 추출하기 위한 SDS-PAGE 겔 내 분해 방법을 보여줍니다. 일단 분리되면, 얻어진 단백질 단편은 단백질체학 분석에 사용될 수 있습니다.

프로토콜

1. EV의 특성화

1. 웨스턴 블롯 분석
   1. 단백질 추출
      1. 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC)으로 EV를 분리하고 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 정량화합니다.
      2. 50μL의 RIPA 완충액(150mM 염화나트륨[NaCl], 50mM 트리스, 5mM 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산[EGTA], 2mM 에틸렌디아민-테트라아세트산[EDTA], 100mM 불화나트륨[NaF], 10mM 피로인산나트륨, 1% 노니데트 P-40, 1mM 페닐메탄설포닐플루오라이드[PMSF], 1x 프로테아제 억제제)를 EV 샘플(필터의 EV 농도에서 결과 25μL)과 얼음에서 5분 동안 혼합합니다. 단백질을 추출합니다.
      3. 얼음 위에서 5 초 (진폭 : 500W, 주파수 : 20kHz) 동안 초음파 처리합니다.
      4. 20,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 수포 파편을 제거합니다.
      5. 상층액을 수집하고 Bradford 단백질 분석 방법으로 단백질 농도를 측정합니다.
   2. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 웨스턴 블로팅
      1. 단백질 추출물(30μg)과 5c Laemmli 샘플 버퍼(v/v)를 혼합합니다.
      2. 단백질 혼합물을 12% 폴리아크릴아미드 겔에 로드합니다.
      3. TGS 완충액(25mM Tris pH 8.5, 192mM 글리신 및 0.1% SDS)을 사용하여 70V에서 15분 동안 및 120V에서 45분 동안 겔의 단백질을 마이그레이션합니다.
      4. 단백질을 230V에서 30분 동안 반건조 시스템으로 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮깁니다.
      5. 차단 버퍼(0.05% Tween 20 w/v, 0.1 M PBS, pH 7.4에서 5% 분유 w/v)로 RT에서 1시간 동안 멤브레인을 포화시킵니다.
      6. 차단 버퍼(1:100)에 희석된 마우스 단클론 항인간 열 충격 단백질 90(HSP90) 항체를 사용하여 4°C에서 밤새 멤브레인을 배양합니다.
      7. PBS-Tween(PBS, 0.05% Tween 20 w/v)으로 멤브레인을 15분 동안 세 번 세척합니다.
      8. 차단 완충액(1:10,000)에 희석된 염소 양고추냉이 과산화효소 접합 항-마우스 IgG 2차 항체를 사용하여 RT에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다
         참고: 음성 대조군은 2차 항체만 사용하여 수행됩니다.
      9. 세탁 단계를 반복합니다(단계 1.1.2.7).
      10. 향상된 화학발광(ECL) 웨스턴 블로팅 기판 키트로 멤브레인을 드러냅니다(재료 표 참조).

2. 단백질체 분석

1. 단백질 추출 및 인젤 분해
   1. 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC)으로 EV를 분리하고 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 정량화합니다. EV 단백질 추출을 위해 1.1.1단계를 반복합니다.
   2. 12% 폴리아크릴아미드 겔의 스태킹 겔에서 단백질 이동을 수행합니다.
   3. RT에서 20분 동안 Coomassie blue로 젤의 단백질을 고정합니다.
   4. 각 착색 된 젤 조각을 절제하고 1mm의 작은 조각으로 자릅니다³.
   5. 초순수 15분, 100% 아세토니트릴(ACN), 15분 동안 100mM 중탄산암모늄(NH₄HCO₃), ACN:100mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) 15분, 100% ACN을 연속 교반으로 5분 동안 각 용액 300μL로 연속적으로 세척합니다.
   6. 진공 농축기로 젤 조각을 완전히 건조시킵니다.
   7. 56°C에서 1시간 동안 10mM 디티오트레이톨을 함유한 100μL의 100mM NH₄HCO₃로 단백질 감소를 수행합니다.
   8. 50mM 요오드아세트아미드를 함유한 100μL의 100μL로 단백질 알킬화를 수행합니다.
   9. 각 용액 300 μL로 겔 조각을 연속적으로 세척합니다 : 100 mM의 NH₄HCO₃ 15 분 동안, ACN : 20 mM NH₄HCO₃ (1 : 1, v / v) 15 분 동안, 100 % ACN 5 분 동안 연속 교반.
   10. 진공 농축기로 젤 조각을 완전히 건조시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토니트릴	피셔 화학 물질	A955-1
중탄산암모늄	시그마-알드리치	9830
HSP90 α/β 항체 (RRID: AB_675659)	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-13119
Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축액(Bradford)	바이오 라드	5000006
디티오트레이톨	시그마-알드리치	제43819
에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N ', N'- 테트라 아세트산	시그마-알드리치	03777-10지
에틸렌디아민테트라아세트산	시그마-알드리치	ED-100G
Fisherbrand Q500 초음파 발생기(프로브 포함)	피셔브랜드	12893543
이도아세트아미드	시그마-알드리치	I1149
인스턴트블루 쿠마시 단백질 스테인	익스페디온	ISB1L
램리 2x	바이오 라드	1610737
노니뎃 P-40	플루카	56741
Peroxidase Affini순수 염소 안티마우스 IgG (H+L)	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 115-035-003
팔로이딘-테트라메틸로다민 접합체	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-362065
프로테아제 억제제	시그마-알드리치	S8830-20탭
소금	샬라우	SO0227
나트륨 도데 실 설페이트	시그마-알드리치	L3771
불화나트륨	시그마-알드리치	S7920-100G
피로인산나트륨	시그마-알드리치	S6422-100G
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