마우스 모델에 두개골 이미징 창 이식: 쥐 뇌 영역에 대한 안정적인 광학적 접근을 위해 유리 기반 커버슬립을 이식하는 수술 절차

초록

출처: Alieva, M. et al. 침습적 외과적 생검에 대한 반응으로 뇌종양 세포 행동의 종단내 영상.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오는 뇌의 다른 영역에 대한 안정적인 광학 접근을 위해 마우스 모델에 두개골 창을 이식하는 수술 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 종양 세포 이식 및 두개골 이미징 창 준비

1. 수술 준비
   1. 모든 균주 또는 성별의 성체 마우스(>6주령)를 사용하십시오. 멸균수에 플루아니손[신경이완제] + 펜타닐[오피오이드])(0.4mL/kg) + 벤조디아제핀 진정제(2mg/kg)를 1:1:2의 용량으로 주사하여 마우스를 진정시킵니다. 발가락 꼬집기로 동물의 진정 상태를 평가합니다.
      메모: 이 프로토콜에서는 이러한 실험에 사용된 종양 세포주(GL261)와 동일한 유전적 배경으로 인해 암컷 및 수컷 C57BL/6 마우스가 모두 사용되었습니다. 마우스는 1.5시간 동안 완전히 진정 상태를 유지합니다. 또는 이소플루란(1.5%–2% 이소플루란/O₂ 혼합물)과 같은 흡입 마취제를 사용합니다.
   2. 정위 프레임에 마우스를 장착하고 코 cl을 사용하여 머리를 고정합니다.amp 그리고 두 개의 이어바.
   3. 난방 램프를 사용하여 체온을 유지하십시오.난방 lamp 주의해서 사용해야 하며 또는 물 재순환 가열 패드를 사용할 수 있습니다.
   4. 쥐의 각막이 건조해지지 않도록 안구를 바르십시오.
   5. 날카로운 가위를 사용하여 두개골(쥐의 눈에서 두개골 기저부까지의 등 부위)의 털을 면도하고 노출된 피부를 70% 에탄올로 소독합니다.
   6. 날카로운 가위로 피부를 원을 그리며 자르고 면봉으로 아래의 골막을 긁어냅니다. 리도카인 1% + 에피네프린 1:100,000 한 방울을 5분 동안 바르고 면봉으로 여분을 제거합니다.
   7. 시아노아크릴레이트 접착제로 피부 가장자리를 두개골에 붙입니다.
   8. 정위 프레임을 4배 배율로 해부 실체 현미경 아래에 놓습니다.
   9. 해부 현미경을 통해 두개골을 시각화하고 오른쪽 두정골 위에 직경 5mm의 원형 홈을 뚫습니다. 이 단계는 두개골에 가해지는 압력을 피하면서 피상적으로만 조심스럽게 수행하십시오.
   10. 피질 완충액(125mM NaCl, 5mM KCl, 10mM 포도당, 10mM HEPES 완충액, 2mM MgSO₄ 및 2mM CaCl₂[pH 7.4]) 한 방울을 바르고 얇은 집게를 사용하여 뼈 플랩을 들어 올립니다.
   11. 다음 단계에서는 달리 명시되지 않는 한 뇌 표면을 피질 완충액으로 덮은 상태로 유지합니다.
   12. 해부 현미경으로 뇌 표면을 시각화하고 구부러지고 가늘어지는 매우 미세한 점 핀셋을 사용하여 경막을 제거합니다. 이 단계에서 출혈이 발생하면 흡수성 젤라틴 스펀지를 사용하여 출혈을 멈춥니다.

2. 두개골 이미징 창 준비

1. 피질 완충액을 제거하고 개두술 부위에 실리콘 오일 한 방울을 떨어뜨려 창 아래의 기포를 방지합니다.
2. 노출된 뇌를 6mm 커버슬립으로 밀봉합니다. 커버슬립과 두개골 사이에 시아노아크릴레이트 접착제를 바릅니다. 뇌와 커버슬립 사이의 거리를 최소화하기 위해 가는 핀셋을 사용하여 커버슬립을 두개골에 부드럽게 누릅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25G x 16mm 피하 주사 바늘	BD 마이크로랜스
흡수성 젤라틴 스펀지	화 이자	300600
원형 커버슬립 6mm	VWR 국제		젤폼
시아노아크릴레이트 접착제	파텍스	우편번호 631-0168	패텍스 울트라 젤
치과 용 시멘트	버텍스 덴탈		Vertex 자체 경화
훈련	드레멜		Dremel 3000 (치과 드릴이 더 편리 할 수 있음) + 105 조각 커터
가는 곡선 핀셋	뒤몽
실리콘 오일	시그마 알드리치	AGT508
입체식 프레임	스톨팅	181838
수술용 실체 현미경	올림푸스		실험실 표준 입체, 쥐 및 마우스
안과 연고	켈라 수의학		Duodrops 베터 켈라 10m
자일로카인 (리도카인 1% + 에피네프린 1:100,000) 국소 마취제	아스트라제네카		자일로카인 (리도카인 1% + 에피네프린 1:100,000)
히프놈	VetaPharma 주식회사		Hypnorm (펜타닐 시트레이트 0.315 mg/mL + 플루아니슨 10 mg/mL)
미다졸람	액타비스		미다졸람 액타비스 5 mg/mL

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