방법 논문

마우스 모델의 두개창 기반 생체 내 이미징: 쥐 모델의 뇌에서 사전 주입된 암세포의 행동을 연구하기 위한 이미징 기술

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Alieva, M. and Rios, A. C. 침습적 외과적 생검에 대한 반응으로 뇌종양 세포 행동의 종적 생체 내 영상.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오에서는 이식된 두개골 창을 통해 마우스 모델에서 사전 주입된 암세포의 생체 내 이미징을 수행합니다. 이 고해상도 타임 랩스 이미징 기술을 통해 살아있는 쥐에서 암세포의 동적 거동을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 생체 내 이미징

참고: 종양 세포 주입과 첫 번째 생체 내 이미징 세션 사이의 시간 간격은 사용된 종양 세포주의 유형에 따라 다릅니다. 이 프로토콜에 표시된 실험을 위해 1x 105 GL261 세포를 주입하고 10일 후에 이미지화했습니다.

  1. 이미징 준비
    1. 안면 마스크(1.5%–2% isoflurane/O2 혼합물)를 통해 isoflurane 흡입 마취를 사용하여 마우스를 진정시킵니다.
    2. 탈수를 방지하기 위해 100μL의 식염수 완충액을 마우스에 피하주사합니다.
      메모: 장기 이미징을 위해 마우스는 피하 주입 펌프를 통해 수분을 공급받을 수 있습니다.
    3. 마우스를 앞면이 위로 향하게 하여 이미징 상자에 넣습니다. 직경 1mm의 구멍이 있는 금속판과 조리개 주위에 작은 자석이 내장된 금속판을 사용하여 CIW를 이미징 상자에 고정합니다. 안면 마스크를 통해 이소플루란을 주입하고 상자 반대쪽에 있는 배출구(0.8%–1.5% 이소플루란/O2 혼합물)로 환기시킵니다. 선택적으로 테이프를 사용하여 마우스 본체를 고정합니다.
      메모: 혈관 시각화를 위한 형광 표지된 덱스트란 또는 기타 염료는 이 시점에서 정맥 주사할 수 있습니다.
    4. 선택적으로 맥박 산소 농도계와 가열 프로브를 사용하여 MOU의 바이탈을 모니터링합니다.
      메모: 이 실험에서는 마우스가 이미징 시간(2-3시간) 동안 안정적이었기 때문에 맥박 산소 농도계와 가열 프로브를 사용할 필요가 없었습니다. 그러나 이미징 시간이 길어지면 보다 철저한 모니터링이 필요할 수 있습니다.
    5. 25x(예: HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5mm) 물 목표를 가장 낮은 z 위치로 설정하고 큰 물방울을 추가합니다.
      메모: 침수 마이크로 디스펜서의 사용은 과학자들이 실험 중에 물을 추가할 수 있도록 하기 때문에 장기 실험에 적극 권장됩니다. 또는 건식 대물렌즈를 사용할 수 있습니다.
    6. 37°C로 유지되는 어두운 기후 챔버가 장착된 현미경으로 이미징 상자를 옮깁니다. 물방울이 닿을 때까지 대물렌즈를 CIW 커버슬립으로 가져옵니다.
    7. 에피형광 모드를 사용하여 접안렌즈를 통해 종양을 관찰하고 세포에 초점을 맞춥니다.

2. 타임랩스 이미지 획득

  1. 이미지화할 여러 관심 위치를 선택하고 해당 좌표를 소프트웨어에 기록합니다. 선택한 위치가 종양의 다른 부위에서 대표하는 위치인지 확인합니다(각 종양은 다를 수 있지만 일관성을 보장하기 위해 모든 마우스에서 종양 코어와 가장자리의 중심에 있는 동일한 양의 위치를 선택합니다).
    메모: 종양의 일부 또는 눈에 보이는 전체 종양의 타일 스캔이 수행될 수 있습니다. 그러나 종양이 큰 경우 이 방법은 이미지 사이의 시간 경과를 증가시킵니다. 또한 종양 세포가 빠르게 움직이면 시간이 지남에 따라 동일한 세포를 추적하기 어려울 수 있습니다.
  2. 다광자 모드로 전환하고 레이저를 올바른 파장으로 조정합니다. 광손상을 방지하려면 더 높은 파장이 필요합니다.
    메모: Dendra2 이미징의 경우 960nm 파장이 사용되었습니다. 이러한 실험에 사용된 대물렌즈를 사용하면 1.3의 줌만으로도 종양 핵의 양호한 해상도를 얻고 종양의 대표 영역을 스캔하기에 충분했습니다.
  3. 라이브 모드로 이동하여 각 위치에 대한 z-stack을 정의하여 종양 세포 해상도를 손상시키지 않고 종양 세포의 최대 부피를 획득합니다. 이미지 사이의 스텝 크기를 3μm로 정의합니다.
  4. 양방향 모드를 사용하여 스캔 속도를 높입니다. 이미지 해상도는 512 x 512 픽셀 이상이어야 합니다.
  5. 2시간 동안 20분마다 다른 위치에서 종양 부피의 이미지를 획득합니다. 각 이미지 획득 전에 대물렌즈에 물을 추가합니다.
    메모: 타임랩스 이미지는 소프트웨어에서 올바른 타임랩스를 설정하여 자동으로 획득할 수 있습니다. 그러나 마우스가 이동할 수 있으며 시간이 지남에 따라 위치 또는 z 스택이 이동하여 데이터가 손실될 수 있습니다. 따라서 타임랩스를 수동으로 수행하고 획득 사이의 xyz 이동을 확인하고 조정하는 것이 좋습니다.
  6. 이 단계에서 선택적으로 Dendra2 형광 마커를 사진 전환합니다.
    메모: 타임 랩스 이미징(개별 종양 세포의 특성과 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는지 연구할 수 있음)과 달리 이를 통해 며칠에 걸쳐 뇌의 종양 세포 침투 영역을 연구
    7. 할 수 있습니다.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안과 연고 켈라 수의학Duodrops 베터 켈라 10m
히프놈 VetaPharma 주식회사Hypnorm (펜타닐 시트레이트 0.315 mg/mL + 플루아니슨 10 mg/mL)

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