형광 기반 트랜스웰 대식세포 유인 분석법: 화학적 유도 화학주성을 통한 종양-대식세포 상호작용을 연구하기 위한 체외 방법

초록

출처: An, Z. et al. 종양-대식세포 상호작용을 연구하기 위한 시험관 내 분석. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 형광 기반 트랜스웰 대식세포 상호작용 분석을 사용하여 종양-대식세포 상호작용을 연구합니다. 이 분석에는 화학적 유도 화학주성을 통한 대식세포의 이동 분석이 포함됩니다.

프로토콜

1. 체외 대식세포 유인 분석

1. 컨디셔닝 배지의 준비

1. 종양 세포 유지 배지를 37°C 수조에서 20분 동안 예열합니다.
2. 조직 배양 후드 표면에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면의 70% 에탄올을 닦아냅니다. 냉장고에서 세포 분리 용액을 꺼냅니다. 배지와 세포 분리 용액의 병에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면의 70% 에탄올을 닦아낸 다음 조직 배양 후드로 가져옵니다.
3. 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 꺼냅니다. 컨디셔닝된 배지를 15mL 멸균 원심분리 튜브에 조심스럽게 피펫팅합니다. 튜브를 얼음 위에 올려 놓습니다. "배지 전용"의 배지를 별도의 15mL 멸균 원심분리 튜브에 피펫으로 넣습니다.
   참고: 이 단계를 수행하기 전에 현미경 아래에서 세포가 부착되어 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 코팅된 플레이트를 사용하여 더 나은 부착을 허용하거나 계수 단계에서 부동 셀을 포함할 수 있습니다.
4. 0.5mL의 세포 분리 용액을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 종양 세포가 매분마다 둥글게 모이는지 확인하십시오. 종양 세포가 둥글게 되면 세포가 분리될 수 있도록 플레이트의 측면을 부드럽게 두드린다.
5. 2.5mL의 종양 세포 유지 배지를 웰에 피펫으로 넣고 위아래로 3회 피펫팅하여 세포를 혼합하고 15mL 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 10μL를 Trypan Blue 용액 10μL와 혼합합니다. 혼합물 10 μL를 카운팅 슬라이드에 피펫팅하고 자동 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포의 수를 정량화합니다.
6. 무혈청 줄기세포 배지를 사용하여 세포 수에 따라 조절된 배지의 부피를 조정합니다(하룻밤 37°C 배양). 예를 들어, Well A에 세포 수가 가장 적은 well보다 3배 많은 살아있는 세포가 있는 경우 컨디셔닝된 배지를 1:3으로 희석합니다. 이 단계는 세포 증식 속도에 따른 차이를 제어하는 데 사용됩니다.
   메모: 하룻밤 동안 37°C에서 배양하여 무혈청 줄기세포 배지를 사용하는 이유는 37°C에 장기간 노출될 경우 배지의 가능한 변화를 제어하기 위함입니다.
7. 0.45μm 필터를 통해 컨디셔닝된 매체를 필터링합니다. 조절된 미디어를 얼음에 놓습니다.
   참고: 이 단계는 조절된 배지에서 세포와 세포 파편을 제거합니다.

2. MV-4-11 셀의 준비

1. IMDM 매체(FBS 제외)를 37°C 수조에서 20분 동안 예열합니다.
2. 조직 배양 후드 표면에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면의 70% 에탄올을 닦아냅니다. 중간 병에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면의 70% 에탄올을 닦아낸 다음 조직 배양 후드로 가져옵니다.
3. MV-4-11 세포의 플라스크를 조직 배양 후드로 가져갑니다. 10mL의 세포를 15mL 멸균 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 10 μL의 세포를 10 μL의 Trypan Blue 용액과 혼합합니다. 혼합물 10 μL를 카운팅 슬라이드에 피펫팅하고 자동 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포의 수를 정량화합니다. 4°C에서 5분 동안 200 x g에서 세포를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
4. PBS 10mL로 세포를 세척하고 4°C에서 5분 동안 200 x g에서 세포를 원심분리합니다. 상층액을 흡인합니다.
5. IMDM 배지(FBS 제외)에서 세포를 재현탁하여 최종 세포 밀도가 1x10⁶ cells/mL.
   이 되도록 합니다. 참고: 여기에 사용된 대식세포의 세포 수를 조정할 수 있습니다.

3. 트랜스웰 분석

참고: 이 단계에서는 세포 이동 분석 키트를 사용하거나 시약을 구입하여 별도로 삽입하십시오. MV-4-11 셀의 경우 공극 크기가 5μm인 Transwell inserts를 선택합니다. 대식세포 이동을 감지하려면 하부 챔버에 있는 대식세포의 수를 직접 정량화하거나 비색/형광 측정 방법을 사용하십시오. 여기에서는 비색법을 사용한 분석을 시연합니다.

1. 24웰 플레이트, 인서트 및 시약을 실온으로 가져옵니다.
2. 위에서 준비한 MV-4-11 세포 250 μL를 각 삽입물에 추가합니다.
3. 400 μL의 컨디셔닝된 배지/배지만 추가합니다(37 °C에서 하룻밤 배양, 이 샘플은 음성 대조군 역할을 함). 각 종양주 또는 대조군에 대해 3중 샘플을 사용합니다. 인서트와 컨디셔닝된 매체 사이에 기포가 생기지 않도록 하십시오. 거품은 대식세포가 바닥 우물로 이동하는 것을 억제합니다.
4. 37 ° C 인큐베이터에서 5 % CO₂로 플레이트를 4 h.
   동안 배양합니다. 알림: 배양 시간을 조정할 수 있습니다. 하부 챔버로 이동하는 세포는 현미경으로 볼 수 있습니다.
5. 같은 우물의 내벽에 삽입물을 부드럽게 두드리고 삽입물을 버립니다. MV-4-11 세포는 현탁액에서 성장하기 때문에 세포 분리 용액이나 트립신 처리는 여기에 필요하지 않습니다.
6. 웰의 세포를 위아래로 3회 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 225μL의 세포 현탁액을 형광 측정에 적합한 검은색 벽의 96웰 플레이트로 이동합니다.
7. CyQuant 염료 1:75를 4x 용해 버퍼로 희석합니다. Vortex를 간단히 실행하고 솔루션을 스핀 다운합니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 75μL의 용액을 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
8. 형광 플레이트 리더가 있는 480/520nm 필터 세트를 사용하여 형광을 판독합니다.
9. 블랭크를 빼고 대조 종양 세포주에 정규화하여 데이터를 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 mL 혈청학적 피펫	올림푸스 플라스틱	12-104
15 mL 멸균 원심분리기 튜브	올림푸스 플라스틱	28-103
1 mL 피펫 팁	ART 분자 바이오 제품	2779-RI
2 mL 흡입 피펫	송골매	357558
24웰 플레이트	밀리포어	ECM507	ECM507의 일부일 수 있습니다 별도로 구매
4x 용해 버퍼	밀리포어	ECM507	ECM507의 일부일 수 있습니다 별도로 구매
5 μm 트랜스웰 인서트	밀리포어	ECM507	ECM507의 일부일 수 있습니다 별도로 구매
아카쿠타아제	혁신적인 셀 기술	AT-104
나27	지브코	제12587-010
CyQuant 염료	밀리포어	ECM507	ECM507의 일부일 수 있습니다 별도로 구매
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11965-092
DMEM: F12	지브코	제10565-018
증권 시세	페프로텍	AF-100-15
FBS(증권 시세	지브코	26140
증권 시세	페프로텍	100-18B
국제경영시스템(IMDM	지브코	제12440-053
PBS (PBS)	지브코	14190-144
펜 스트렙	지브코	15140-122
트리판 블루	비오라드	1450021

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