Extracellular Vesicle Extraction: 차등 원심분리를 사용하여 전체 조직 표본에서 세포외 소포를 분리하는 기술

초록

출처: Hurwitz, S. N. et al. 전체 조직에서 세포 외 소포 추출. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 신선 조직 또는 냉동 조직에서 세포 외 소포를 추출하는 기술에 대해 설명합니다. 분리된 세포외 소포체는 질병 발병기전에서 중요한 역할을 밝히기 위한 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 조직 해리 및 차등 원심분리

1. 약 0.4–1.0g의 조직에 대해 Hibernate-E 배지에서 10mL의 해리 완충액(파파인 10mg, 5.5mM L-시스테인, 67μM 2-메르캅토에탄올, 1.1mM EDTA)을 준비합니다.
   참고: EV 농축 및 정화에 사용되는 모든 용액은 초순수 여과수에 희석해야 합니다.
2. 50mL 원뿔형 튜브의 해리 완충액에 신선 또는 냉동 조직 전체를 추가하고 37°C의 따뜻한 수조에서 20분 동안 배양합니다. 필요한 경우 배양 전에 조직을 더 작은 조각으로 절단할 수 있습니다.
3. 배양 후, 조직을 포함하는 해리 완충액에 최종 1x 농도를 위해 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제를 추가합니다.
4. 조직이 포함된 용액을 헐렁한 Dounce 균질기에 붓고 샘플당 약 30번의 느린 스트로크를 사용하여 조직을 부드럽게 분리합니다. 뇌졸중 횟수는 조직의 일관성에 따라 조정될 수 있습니다.
5. 완충액에 있는 해리된 조직을 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 4°C에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리하여 세포와 남아 있는 섬유질 또는 응집성 조직 단편을 펠렛화합니다.
6. 상층액을 깨끗한 50mL 코니컬 튜브에 옮기고 2,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 큰 세포 파편을 펠릿화하고 폐기합니다.
7. 상층액을 깨끗한 50mL 원뿔형 튜브에 다시 옮기고 4°C에서 40분 동안 10,000 x g의 원심분리기를 사용하여 원하지 않는 큰 소포체 또는 작은 세포사멸체를 펠릿화합니다.
   참고: 이 펠릿은 원하는 경우 더 큰 소포에 대한 추가 연구를 위해 저장할 수 있습니다.
8. 0.45μm 필터를 통해 상층액을 깨끗한 12mL 초원심분리 튜브에 디캔팅합니다.
   메모: 조밀한 섬유성 조직 샘플은 쉽게 필터링되지 않을 수 있습니다. 이러한 샘플은 40μm 세포 스트레이너를 통해 여과한 다음 0.45μm 필터를 통해 여과하기 전에 연속적으로 더 작은 바늘(18G, 20G, 22G)을 통과할 수 있습니다.
9. 100,000 x g에서 4°C에서 2시간 동안 샘플을 초원심분리하여 소형 EV를 펠릿화합니다.
10. 상층액을 디캔팅하고 초원심분리 튜브를 5-10분 동안 거꾸로 두고 자주 두드려 튜브 측면에 남아 있는 액체를 제거합니다. 잔류 유체는 흡입 진공 피펫을 사용하여 흡입할 수도 있습니다.
11. EV 펠릿을 1.5mL의 0.25M 자당 완충액(10mM Tris, pH 7.4)에 다시 현탁시킵니다. 이 단계에서 펠릿의 완전한 재현탁을 보장하는 것이 중요합니다. 그렇게 하려면 EV를 용액으로 와류로 만들기 전에 튜브를 파라필름으로 덮으십시오. 최종 와류 혼합물을 혼합하기 전에 실온에서 15-20분 동안 초원심분리기 튜브를 흔듭니다.
12. 1,000 x g 이하의 속도로 튜브를 잠시 원심분리하여 튜브 바닥의 액체 현탁액을 회수합니다.
13. 아래의 그래디언트 정제 단계를 진행하거나 필요한 경우 EV 서스펜션을 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.45μm 필터	폭스바겐	제28145-505
12mL 초원심분리기 튜브	벡크만 쿨터	331372
5.5mL 초원심분리기 튜브	벡크만 쿨터	344057
HALT 인산가수분해효소 억제제(100x 용액)	써모피셔 사이언티픽	78420
HALT 프로테아제 억제제(100x 용액)	써모피셔 사이언티픽	78438
최대 절전 모드 E 매체	써모피셔 사이언티픽	A1247601
MLS-50 스윙 버킷 로터	벡크만 쿨터	367280
Optima MAX-XP 벤치탑 초원심분리기	벡크만 쿨터	393315