Purification of subpopulations of extracellular vesicles: A technique to purify subpopulations of extracellular vesicles using Density Gradient Ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리를 사용하여 세포외 소포의 하위 집단을 정제하는 기술)

초록

출처: Urwitz, S. N. et al. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. 특급. (2019년)

이 동영상은 특성화 연구에 적합한 세포외 소포체의 하위 집단을 분리하기 위한 밀도 구배 초원심분리 기반 정제 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 밀도 구배 정제

1. EV가 포함된 1.5mL 자당/트리스 완충액에 60% 요오딕산올 1.5mL(물 속 원액) 1.5mL를 추가하여 30% 요오딕산올을 포함하는 최종 용액을 만듭니다. 용액을 철저히 혼합하기 위해 여러 번 위아래로 피펫팅합니다.
   메모: 피펫 팁에서 용액이 손실되지 않도록 주의하십시오., 높은 요오딕산올 농도는 매우 점성이 있으므로 주의하십시오.
2. EV가 포함된 30% 요오딕산올 완충액을 5.5mL 초원심분리 튜브의 바닥으로 옮깁니다.
3. 60% 요오딕산올 원액의 초순수에 시료당 최소 1.5mL의 20% 및 10% 요오딕산올 용액을 준비합니다.
4. 20% 요오딕산올 1.3mL를 측정하고 주사기와 18G 바늘을 사용하여 하단 그라디언트 층 위에 조심스럽게 겹칩니다. 밀도 계면에서 층이 혼합되는 것을 방지하려면 바늘의 베벨이 반월상 연골 바로 위의 초원심분리 튜브 내부와 접촉하도록 하고 용액을 적가적으로 첨가하십시오.
5. 위와 동일한 기술을 사용하여 20% 요오딕산올 층 위에 1.2mL의 10% 요오딕산올 용액을 겹쳐 놓습니다.
6. 초원심분리 튜브의 균형을 조심스럽게 잡고 4°C에서 50분 동안 268,000 x g의 스윙 버킷 로터에서 원심분리기에 넣습니다. 밀도층의 중단을 방지하기 위해 원심분리기의 가속 및 감속 속도를 허용되는 최소 속도로 설정합니다.
7. 각 샘플에 대해 10개의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 밀도 구배의 분획 1에서 10에 해당하는 레이블로 표시합니다. 분수 1은 가장 먼저 제거될 최상위 분수로 지정되고 분수 10은 마지막으로 제거될 맨 아래 분수입니다.
8. 그래디언트 초원심분리가 완료되면 로터 버킷에서 튜브를 부드럽게 제거하고 안정적인 홀더에 넣습니다. 눈에 보이는 소포 띠는 종종 관심 부분에서 볼 수 있습니다. 그래디언트 상단에서 490 μL의 10개의 연속 분획을 해당 튜브로 피펫팅합니다. 튜브 바닥에 오염 단백질을 포함할 가능성이 있는 소량의 액체가 남아 있을 것입니다. 원하는 경우 이 샘플을 폐기하거나 분수 11로 유지할 수 있습니다.
9. 굴절계를 사용하여 분수의 굴절률을 측정합니다. 이는 샘플 보존이 필요한 경우 병렬로 실행되는 제어 그래디언트를 사용하여 수행할 수도 있습니다. 요오딕산올을 함유한 각 분획을 굴절계 표면에 20–30μL씩 피펫팅하고 굴절률을 알려진 요오딕산올 밀도와 비교하여 밀도를 추정합니다.
   메모: 분획은 다음 초원심분리 세척 단계로 진행하기 전에 필요한 경우 요오딕산올 함유 용액에 밤새 보관할 수 있습니다.
10. 각 분획을 깨끗한 12mL 초원심분리 튜브로 옮깁니다. 1x 인산염 완충 식염수 5mL(PBS; 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄, pH 7.4)를 튜브에 넣고 천천히 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
    참고: 샘플에 첨가된 PBS는 입자가 없어야 하며, 0.22μm 필터를 통해 멸균 PBS를 여과하고 염분 침전을 방지하기 위해 실온에서 보관해야 합니다.
11. 상단에 6mL의 1x PBS를 추가하고 다시 조심스럽게 섞습니다.
12. 100,000 x g에서 튜브를 4°C에서 2시간 동안 초원심분리하여 작은 소포를 다시 펠릿화합니다. 단백질 분석을 위해 소포를 용해하거나 형태학적 분석을 위해 EV를 재현탁하기 전에 상층액을 디캔팅하고 튜브를 두드려 건조시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.45μm 필터	폭스바겐	제28145-505
12mL 초원심분리기 튜브	벡크만 쿨터	331372
5.5mL 초원심분리기 튜브	벡크만 쿨터	344057
FA-45-6-30 로터	에펜도르프	5820715006
MLS-50 스윙 버킷 로터	벡크만 쿨터	367280
Optima MAX-XP 벤치탑 초원심분리기	벡크만 쿨터	393315
Optima XE-100 초원심분리기	벡크만 쿨터	A94516
옵티프렙	시그마	D1556	멸균수 용액에 60% 요오딕산올
굴절계 30PX (굴절계)	메틀러 톨레도	51324650
S-4-104 로터	에펜도르프	5820759003
SW 41 Ti 스윙 버켓 로터	벡크만 쿨터	333790
테이블탑 5804R 원심분리기	에펜도르프	22623508

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