말초혈액 단핵세포(PBMNC)에서 유도 신경 줄기세포(iNSC) 생성: PBMNC를 iNSC로 재프로그래밍하는 센다이 바이러스 기반 절차

초록

출처: Zheng, W. et al. 말초 단핵 세포에서 유도 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구를 위한 도파민성 뉴런 전구체로의 분화.J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 센다이 바이러스를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMNC)를 유도 신경 줄기 세포(iNSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다. 센다이 바이러스는 세포를 재프로그래밍하기 위한 효율적이고 안전한 수단을 제공하는 비통합형 바이러스입니다.

프로토콜

1. SeV 감염에 의한 PBMNC를 iNSC로 재프로그래밍

1. 용액 및 배양 배지의 제조
   1. PDL 100mg을 H_2O100mL와 1mg/mL의 농도로 용해하여 폴리-D-라이신(PDL) 원액을 준비합니다. -20 °C에서 1 mL 부분 표본에 넣어 보관하십시오.
   2. 0.01N HCl 20mL에 인슐린 100mg을 5mg/mL 농도로 용해시켜 인슐린 스톡 용액을 준비합니다. -20 °C에서 1 mL 부분 표본에 넣어 보관하십시오.
   3. 200mL의 iNSC 기초 배지를 준비하려면 96mL의 DMEM-F12 및 96mL의 염기성 배지(Table of Materials)를 2mL의 100x 글루타민 원액, 2mL의 비필수 아미노산(NEAA), 2mL의 N2 보충제 및 2mL의 B27 보충제와 결합합니다. 사용 전에 10ng/mL 재조합 인간 백혈병 억제 인자, 3μM CHIR99021 및 2μM SB431542를 추가합니다. 매체를 여과하고 4 °C에서 보관하십시오 .
      메모: 2주 이내에 배지를 사용하십시오. 재조합 인간 백혈병 억제 인자, CHIR99021 및 SB431542 사용 직전에 첨가하십시오.
2. SeV 감염에 의한 PBMNC를 iNSC로 재프로그래밍(Reprogramming)
   1. 사용하기 전에 깨끗한 벤치를 자외선 살균하십시오. 모든 표면과 장비를 75% 알코올로 소독하십시오. 오토클레이브를 사용하여 모든 팁을 살균하십시오.
   2. 0일차에 MNC 배지에서 세포를 수집하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상등액을 흡인하고 예열된 MNC 배지 1mL로 세포를 재현탁합니다.
   3. 트리판 블루로 생존 가능한 세포를 세십시오. 24-well plates에서 well당 2 x 10⁵ cells의 농도로 pre-warmed(37°C) MNC 배지로 세포를 재현탁합니다.
   4. -80°C 보관에서 SeV 튜브를 제거한 후 SeV가 포함된 튜브를 37°C 수조에서 5-10초 동안 해동한 다음 RT에서 해동합니다. 해동되면 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오.
   5. 인간 Klf4, Oct3/4, SOX2 및 c-MyC를 인코딩하는 SeV를 감염 다중성(MOI) 10으로 웰에 추가합니다. 세포 부착을 용이하게 하기 위해 1,000 x g의 플레이트가 있는 세포를 30분 동안 원심분리합니다. 플레이트에 세포와 상등액을 그대로 둡니다. 플레이트를 37°C, 5% CO₂.
      의 인큐베이터에 놓습니다. 주의 : SeV와 관련된 모든 절차는 안전 캐비닛에서 수행해야 하며 모든 팁과 튜브는 폐기하기 전에 에탄올 또는 표백제로 처리해야 합니다.
   6. 1일차에 배지와 세포를 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. MNC 배지 1mL로 웰을 헹굽니다. 200 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 24웰 플레이트에 500μL의 신선한 예열 MNC 배지로 세포를 재현탁합니다.
      메모: PDL/라미닌을 도금하기 전에 세포가 부착되지 않도록 부착력이 낮은 24웰 플레이트를 사용하십시오.
   7. 2일차에 1mg/mL PDL 1mL를 D-PBS 19mL로 50μg/mL 농도로 희석합니다. RT에서 최소 2시간 동안 50μg/mL PDL로 6웰 플레이트를 코팅합니다.
   8. 200μL의 0.5mg/mL 라미닌을 20mL의 D-PBS로 5μg/mL의 농도로 희석합니다. 6웰 플레이트에서 PDL을 흡입하고 수직 클린 벤치에서 건조합니다.
   9. 6웰 플레이트에 5μg/mL 라미닌을 코팅하고 37°C에서 4-6시간 동안 배양합니다. 사용 전에 D-PBS로 세척합니다.
   10. 3일차에 1.2.6단계에서 얻은 형질도입 세포를 PDL/라미닌이 코팅된 6-웰 플레이트에 iNSC 배지로 플레이트화합니다.
       메모: 세포를 PDL/라미닌 코팅 플레이트에 놓은 후 필요한 경우 플레이트를 부드럽게 이동하여 세포의 부착을 방해하지 않도록 합니다.
   11. 5일차에 6웰 플레이트의 각 웰에 예열된(37°C) iNSC 배지 1mL를 부드럽게 추가합니다.
       메모: 세포는 급격한 사멸(>60%)을 겪을 것으로 예상됩니다.
   12. 7일차에 6웰 플레이트의 각 웰에 예열된(37°C) iNSC 배지 1mL를 부드럽게 추가합니다.
   13. 9일차부터 28일차까지 사용한 배지를 매일 예열된(37°C) iNSC 배지로 교체하십시오. iNSC 콜로니의 출현을 모니터링합니다. 약 2-3주 내에 확장을 위해 iNSC 클론을 선택하고 이전할 수 있습니다. 오염 가능성이 있는 세포를 제외한 연소된 유리 피펫을 사용하여 적절한 형태의 콜로니를 선택하고 200μL 팁으로 콜로니를 흡인합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B27 보충제	인비트로젠	17504044
CHIR99021	유전자 조작	제04-0004
DMEM-F12	지브코	11330
DMEM-F12	지브코	11320
라미닌	로슈	11243217001
N2 보충제	인비트로젠	17502048
네아	인비트로젠	11140050	비필수 아미노산
뉴로기저	지브코	10888	기본 매체
PDL	시그마-알드리치	P7280	폴리-D-라이신
SB431542	유전자 조작	04-0010-10MG	-20도의 빛에서 보관하시겠습니까?
센다이 바이러스	생명 기술	MAN0009378
인슐린	로슈	12585014
24웰 플레이트	코 닝	3337
15ml 원뿔형 튜브	코 닝	430052
6웰 플레이트	코 닝	3516
유럽 특허청	페프로텍	100-64-50UG	인간 에리스로포이에틴
인간 백혈병 억제 인자	밀포어	LIF1010
인간 재조합 SCF	페프로텍	300-07-100UG
IGF-1	페프로텍	100-11-100UG	인간 인슐린 유사 성장 인자
일리노이 -3	페프로텍	200-03-10UG	인간 인터루킨 3
덱사메타손	시그마-알드리치	D2915-100MG
국제경영시스템(IMDM	지브코	제215056-023	Iscove의 변형된 Dulbecco의 매체
인슐린	로슈	12585014
ITS-X	인비트로젠	51500-056	인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 - X 보충제
글루타맥스	인비트로젠	21051024	100 × 글루타민 원액
햄스-F12	지브코	11765-054
1-티오글리세롤	시그마-알드리치	M6145	흡입 및 피부 접촉에 유독합니다.
아스코르브산	시그마-알드리치	A92902	피부 접촉시 유독 함
Knockout 세럼 교체	지브코	10828028	무혈청 기초 배지
화학적으로 정의된 지질 농축액	인비트로젠	11905031
트랜스페린	R&D 시스템	2914-HT-100G
트리판 블루	지브코	T10282

호 년 년 년 (영문) 년 (영어) ) 호 년 년