순환 무세포 DNA(cfDNA)의 분리: 암 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출하는 실리카 기반 멤브레인 절차

초록

출처: Palande, V. et al. 암 환자의 혈장 샘플에서 cell-free DNA 검출. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 인간 혈장 샘플에서 순환 무세포 DNA 또는 cfDNA를 분리하기 위한 실리카 기반 멤브레인 절차를 설명합니다. cfDNA는 암 진단 및 평가를 위한 유망한 바이오마커입니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 혈장 1 mL에서 순환 cfDNA 정제

참고: 이 단계는 상용 키트를 사용하여 수행됩니다(재료 표 참조). 모든 버퍼는 키트와 함께 제공됩니다.

1. 완충액 및 시약의 제조
   주의: 산성 용액이나 표백제를 시료 전처리 폐기물에 직접 첨가하지 마십시오. Lysis buffer, Binding buffer 및 Wash Buffer-1에 존재하는 구아니딘 염은 표백제 또는 산과 결합할 때 반응성이 높은 화합물을 생성할 수 있습니다.
   1. 결합 완충액: 300mL의 결합 완충액 농축액과 200mL의 100% 이소프로판올을 혼합하여 500mL의 결합 완충액을 만듭니다. 실온에서 보관하십시오.
      메모: 결합 완충액은 순환하는 핵산을 실리카 막에 최적으로 결합할 수 있도록 합니다. 결합 완충액 500mL는 각각 1, 2, 3, 4 또는 5mL의 혈장 시료 276, 138, 92, 69 또는 55개를 처리하기에 충분하며 실온에서 1년 동안 안정적입니다.
   2. 워시 버퍼-1: 19mL의 워시 버퍼-1 농축액과 25mL의 96–100% 에탄올을 혼합하여 44mL의 워시 버퍼-1을 만듭니다. 실온에서 보관하십시오.
      메모: Wash Buffer-1은 실리카 멤브레인에 결합된 오염 물질을 제거합니다. 44 mL의 Working Wash Buffer-1은 1/2/3/4/5 mL의 혈장 시료 73개를 처리하기에 충분하며 실온에서 1년 동안 안정적입니다.
   3. 워시 버퍼-2: 13mL 워시 버퍼-2 농축액과 30mL의 96–100% 에탄올을 잘 혼합하여 43mL의 워시 버퍼-2를 만듭니다. 실온에서 보관하십시오.
      메모: Wash Buffer-2는 실리카 멤브레인에 결합된 오염 물질을 제거합니다. 43mL의 Working Wash Buffer-2는 1/2/3/4/5mL의 플라즈마 샘플을 ~56개 처리하기에 충분하며 실온에서 1년 동안 안정적입니다.
   4. 310 μg 동결건조된 carrier RNA가 들어있는 튜브에 1,550 μL의 용리 완충액을 추가하여 0.2 μg/μL의 carrier RNA 용액을 준비합니다. 운반체 RNA를 완전히 용해시킨 후 용액을 적절한 부분 표본으로 나누고 -30 °C에서 -15 °C에서 보관합니다. 이러한 부분 표본을 3회 이상 동결-해동하지 마십시오. 표 1과 같이 용리 완충액에 용해된 재구성된 운반체 RNA를 용해 버퍼에 추가합니다.
      메모: carrier RNA는 Lysis buffer에서 직접 용해되지 않기 때문에 먼저 용리 완충액에서 용해된 다음 lysis 완충액에서 용해되어야 합니다. 첫째, 실리카 막-핵산 결합은 샘플에 존재하는 표적 분자가 매우 적을 때 향상됩니다. 둘째, 많은 양의 운반 RNA가 존재하기 때문에 RNA 분해 위험이 감소합니다.
2. 분리를 시작하기 전에 컬럼과 샘플을 실온으로 가져오고 필요한 경우 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 샘플 부피를 1mL로 조정합니다. 50mL 원심분리 튜브와 2mL 수집 튜브가 포함된 2개의 수조 또는 가열 블록을 각각 60°C 및 56°C로 예열합니다.
3. 50mL 원심분리 튜브에 100μL의 Proteinase K, 1mL 혈장 및 1.0μg의 carrier RNA가 포함된 0.8mL의 Lysis buffer를 추가합니다(1.1.4단계에서 준비). 캡으로 원심분리기 튜브를 닫고 30초 동안 펄스 와류를 통해 내용물을 혼합하면서 튜브에서 눈에 띄는 소용돌이를 확인합니다. 내용물의 철저한 혼합은 효율적인 용해를 위해 중요합니다.
   메모: 볼텍싱 직후 지체 없이 1.4단계로 진행합니다.
4. 용액을 60°C에서 30분 동안 배양합니다.
5. 캡을 제거하고 결합 완충액 1.8mL를 튜브에 추가한 다음 캡을 삽입한 후 15-30초 동안 펄스 볼텍싱으로 완전히 혼합합니다.
6. 생성된 혼합물을 얼음에서 5분 동안 배양하고 실리카 멤브레인 컬럼을 진공 펌프에 연결된 진공 장치에 삽입합니다. 그런 다음 20mL 튜브 확장기를 열린 컬럼에 단단히 삽입하여 샘플 누출을 방지합니다.
7. 배양된 혼합물을 컬럼의 튜브 익스텐더에 조심스럽게 붓고 진공 펌프를 켭니다. 모든 용해물 혼합물이 컬럼을 완전히 통과한 후 진공 펌프를 끄고 압력을 0mbar로 해제한 다음 튜브 익스텐더를 제거하고 폐기합니다.
   메모: 교차 오염을 피하기 위해 튜브 익스텐더는 인접한 컬럼으로 퍼지는 것을 방지하기 위해 조심스럽게 폐기해야 합니다.
8. 진공 장치에서 컬럼을 제거하고 수집 튜브에 삽입한 다음 실온에서 30초 동안 11,000 x g에서 원심분리하여 잔류 용해물을 제거합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
9. 600μL의 Wash Buffer-1을 컬럼에 추가하고 실온에서 1분 동안 11,000 x g에서 원심분리한 후 플로우 스루를 버립니다.
10. 750μL의 Wash Buffer-2를 컬럼에 추가하고, 실온에서 1분 동안 11,000 x g에서 원심분리한 후 플로우 스루(flow-through)를 폐기합니다.
11. 750μL의 에탄올(96–100%)을 컬럼에 첨가하고 실온에서 1분 동안 11,000 x g에서 원심분리한 다음 플로우 스루를 버립니다.
12. 20,000 x g의 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣어 3분 동안 원심분리합니다.
13. 뚜껑을 연 상태에서 새 2mL 수집 튜브에 멤브레인 컬럼 어셈블리를 넣고 56°C에서 10분 동안 배양하여 완전히 건조시킵니다.
14. 깨끗한 1.5mL 용리 튜브에 컬럼을 넣습니다. 컬럼 멤브레인 중앙에 20–150μL의 용리 완충액을 바르고 뚜껑을 닫은 상태에서 실온에서 3분 동안 배양합니다.
    메모: 용리 버퍼가 실온과 평형을 이루는지 확인합니다. 50 μL 미만의 용리 버퍼를 사용하는 경우, 멤브레인 중앙에 조심스럽게 분배해야 합니다. 이는 결합된 DNA의 완전한 용리에 도움이 됩니다. 그러나 용리 부피는 고정되어 있지 않으며 다운스트림 응용 분야에 따라 변경할 수 있습니다. 회수된 용리액은 최대 5μL일 수 있으며 컬럼에 적용된 용리 부피보다 확실히 적습니다.
15. 회수된 용리액을 20,000 x g의 마이크로 원심분리기에서 1분 동안 원심분리하여 핵산을 용리하고 -20°C에서 보관합니다.

개 호 개 년 개 조 조 개 의 개 분 세 세 년 세 분 년 분 세 의 의 분 년 분 년 세 년 님 분 년 년 분 조 호 분 년 분 년 분 의

샘플 번호	용해 완충액(mL)	용리 완충액의 캐리어 RNA(μL)
1	0.9	5.6
2	1.8	11.3
3	2.6	16.9
4	3.5	22.5
5	4.4	28.1
6	5.3	33.8
7	6.2	39.4
8	7	45
9	7.9	50.6
10	8.8	56.3
11	9.7	61.9
12	10.6	67.5
13	11.4	73.1
14	12.3	78.8
15	13.2	84.4
16	14.1	90
17	15	95.6
18	15.8	101.3
19	16.7	106.9
20	17.6	112.5
21	18.5	118.1
22	19.4	123.8
23	20.2	129.4
24	21.1	135

표 1. 1mL 혈장 시료를 처리하는 데 필요한 Lysis 완충액 및 운반 RNA(용리 완충액에 용해됨)의 부피.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
애질런트 고감도 DNA 키트	애질런트 테크놀로지스, Inc.	5067-4626	High Sensitivity DNA assay는 차세대 염기서열분석 라이브러리의 시료 품질 관리에 자주 사용됩니다.
cf-DNA/cf-RNA 방부제 튜브	노르겐 바이오텍	63950	Norgen의 cf-DNA/cf-RNA 방부제 튜브는 보관 및 배송 중 인간 전혈 샘플에서 cfDNA, 순환 종양 DNA, cf-RNA 및 순환 종양 세포의 수집 및 보존을 위한 밀폐형 진공 플라스틱 튜브입니다
QIAamp 순환 핵산 키트	키아겐	55114	QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit는 인간 혈장 또는 혈청 및 기타 무세포 체액에서 이러한 순환 핵산을 효율적으로 정제할 수 있도록 합니다.
QIAvac 24 Plus 진공 매니폴드	키아겐	19413	QIAvac 24 Plus 진공 매니폴드는 QIAGEN 컬럼의 병렬 진공 처리를 위해 설계되었습니다.
QIAvac 연결 시스템	키아겐	19419	QIAvac Connecting System과 함께 QIAvac 24 Plus 진공 매니폴드를 플로우 스루 시스템으로 사용할 수 있습니다. 감염 가능성이 있는 물질이 포함된 시료 관류는 별도의 폐기물 병에 수거됩니다.
QIAvac 연결 시스템	키아겐	19419	QIAvac Connecting System과 함께 QIAvac 24 Plus 진공 매니폴드를 플로우 스루 시스템으로 사용할 수 있습니다. 감염 가능성이 있는 물질이 포함된 시료 관류는 별도의 폐기물 병에 수거됩니다.
잡다한
50 mL 원심분리기 튜브
으깬 얼음
에탄올 (96–100%)
56°C에서 가열 블록 또는 이와 유사한 것(2mL 수집 튜브 수용 가능)
이소프로판올 (100%)
마이크로 원심분리기
인산염 완충 식염수(PBS)
피펫(조절 가능)
멸균 피펫 팁(교차 오염을 방지하기 위해 에어로졸 장벽이 있는 피펫 팁이 권장됨)
60°C에서 50mL 원심분리기 튜브를 고정할 수 있는 수조 또는 가열 블록